摘要：已有定論？CRISPR、RNAi、ASO哪種更適合lncRNA研究

如何開展lncRNA研究？

LncRNAs是一類長(zhǎng)度在200nt以上，編碼蛋白能力有限的RNA分子。lncRNA基因的過(guò)表達(dá)、缺失或突變與包括癌癥在內(nèi)的許多人類疾病有關(guān)；然而，大多數(shù)lncRNAs的功能仍然是未知的。因此，lncRNAs的功能研究已成為科研工作者關(guān)注的重點(diǎn)。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)為分子生物學(xué)的所有領(lǐng)域提供了一個(gè)革命性的基因組編輯工具。在lncRNA研究中，Cas9核酸酶可以刪除lncRNA基因，或者將RNA去穩(wěn)定元件引入其基因座。核酸酶缺陷型dCas9突變體保留了其RNA依賴性DNA結(jié)合活性，當(dāng)與轉(zhuǎn)錄抑制因子或激活物結(jié)構(gòu)域融合時(shí)可調(diào)節(jié)基因表達(dá)。來(lái)自德國(guó)癌癥研究中心（German Cancer Research Center）Goyal A等研究人員系統(tǒng)地分析了CRISPR方法是否適合靶向lncRNAs。

首先，研究人員對(duì)CRISPR方法用于lncRNAs研究提出了幾點(diǎn)疑問(wèn)：

1、由于ncRNA功能的性質(zhì)，CRISPRn誘變通常不適用于敲除非編碼基因組基因座。

• 首先，負(fù)責(zé)執(zhí)行轉(zhuǎn)錄本依賴性分子功能的lncRNA轉(zhuǎn)錄本序列通常是未確定的，這使得用Cas9對(duì)其進(jìn)行誘變靶向幾乎是不可能的。
• 其次，對(duì)于通過(guò)自身轉(zhuǎn)錄行為發(fā)揮表型的lncRNA位點(diǎn)，這些功能可能不會(huì)受到Cas9誘變的影響，除非Cas9靶向控制lncRNA轉(zhuǎn)錄的調(diào)控區(qū)域，而這對(duì)于大多數(shù)lncRNA來(lái)說(shuō)都是未知的。

2、CRISPRn切除可通過(guò)刪除其啟動(dòng)子或整個(gè)lncRNA基因來(lái)產(chǎn)生lncRNA敲除，但需要考慮所有潛在的基因組調(diào)控元件的位置，這顯然是不太可能的。（lncRNA分類詳見文末小知識(shí)）

• 對(duì)于與其他基因交叉的lncRNA來(lái)說(shuō)，選擇性切除全長(zhǎng)lncRNA位點(diǎn)是不可能的，因?yàn)檫@將不可避免地改變這些基因的序列。
• 對(duì)于由內(nèi)部/雙向啟動(dòng)子產(chǎn)生的lncRNAs，通過(guò)刪除遠(yuǎn)離其啟動(dòng)子并且不與任何其他基因重疊的lncRNA部分，可能產(chǎn)生功能性敲除。然而，lncRNA的功能結(jié)構(gòu)域可能位于重疊的外顯子中，而在這種情況下，lncRNA仍具有功能。
• 此外，刪除部分lncRNA而不去除其TSS可能導(dǎo)致新基因體的產(chǎn)生。在任何情況下，基因組切除都可能導(dǎo)致調(diào)節(jié)DNA元件的缺失，這可能會(huì)影響其他基因的轉(zhuǎn)錄，并導(dǎo)致原本不屬于lncRNA的表型。

3、通過(guò)同源定向敲入lncRNA基因TSS下游的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)或RNA去穩(wěn)定化元件，CRISPRn HR可用Cas9敲低lncRNA。然而，CRISPRn HR策略不能用于由內(nèi)部啟動(dòng)子產(chǎn)生的lncRNA，也不能用于其啟動(dòng)子近端區(qū)域跨越其他基因而又不干擾其序列的lncRNA。

4、CRISPRa和CRISPRi涉及將dCas9募集到靶基因的啟動(dòng)子近端區(qū)域，很可能影響鄰近基因的表達(dá)。因此，該技術(shù)不適合用于調(diào)節(jié)由雙向啟動(dòng)子或位于其他基因起始位點(diǎn)附近的啟動(dòng)子引起的lncRNA。并且將dCas9靶向內(nèi)部啟動(dòng)子也可能干擾宿主基因的轉(zhuǎn)錄。

因此，研究人員將上述所有的位點(diǎn)結(jié)構(gòu)進(jìn)行歸納，根據(jù)對(duì)鄰近基因的潛在影響，提出以下標(biāo)準(zhǔn)規(guī)則：

1. CRISPR方法不適合用于雙向啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的lncRNAs（正義、反義和基因間）；
2. CRISPR方法不適合用于近端啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的lncRNAs（正義、反義和基因間），當(dāng)lncRNA的起始點(diǎn)位于鄰近基因起始位置接近2000bp時(shí)，稱之為“近端啟動(dòng)子”；
3. CRISPR方法不適合用于內(nèi)部啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的lncRNAs（正義和反義）。

隨后，全基因組分析顯示大多數(shù)lncRNAs不能被CRISPR/Cas9靶向

許多l(xiāng)ncRNAs來(lái)源于雙向啟動(dòng)子或者與正義/反義基因的啟動(dòng)子/基因體重疊。根據(jù)定義的lncRNA和啟動(dòng)子類型對(duì)所有由Gencode注釋的lncRNAs進(jìn)行分類。發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)lncRNAs占所有l(wèi)ncRNAs的64％，其中40％為反義lncRNAs，而由于多個(gè)相鄰基因的影響，正義lncRNAs只占13%，正反義類別占11％；基因間lncRNAs占剩余的36％。從獨(dú)立的啟動(dòng)子和內(nèi)部啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來(lái)的lncRNAs各占40%，雙向轉(zhuǎn)錄的lncRNAs占20%。

在全基因組分析中，發(fā)現(xiàn)在15929個(gè)lncRNA基因位點(diǎn)中，只有38％的位點(diǎn)能夠穩(wěn)定（安全）地應(yīng)用CRISPR，而多達(dá)62%的lncRNA基因位點(diǎn)存在引起鄰近基因功能失調(diào)的風(fēng)險(xiǎn)，這主要是由于它們內(nèi)部（35％）或雙向（20％）啟動(dòng)子所引起的。

接著，研究人員通過(guò)各種CRISPR方法對(duì)由雙向啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的lncRNAs NOP14-AS1、LOC389641、MNX1-AS1或HOTAIR進(jìn)行敲低實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這些lncRNAs的表達(dá)顯著被抑制，但同時(shí)也會(huì)影響它們各自鄰近基因的表達(dá)。而基于ASO或siRNA的方法卻可在不影響lncRNAs鄰近基因表達(dá)的情況下敲低該lncRNAs的表達(dá)。

因此，盡管CRISPR/Cas9在雙向和順式調(diào)控表達(dá)方面具有優(yōu)勢(shì)，但基于ASO或siRNA的方法可能是特異性靶向復(fù)雜基因位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄本更好的選擇。

RNAi在lncRNA功能缺失性研究中已經(jīng)得到了廣泛而有效的應(yīng)用。然而，與蛋白質(zhì)編碼基因不同的是，許多l(xiāng)ncRNAs位于核內(nèi)，盡管已經(jīng)發(fā)現(xiàn)RNAi機(jī)制在細(xì)胞核中具有活性，但針對(duì)核內(nèi)lncRNAs的siRNAs往往被證明效果較差。

另一種選擇是反義寡核苷酸(ASOs)，其涉及RNase-H介導(dǎo)的靶RNA裂解。ASOs可以更高效地靶向核lncRNAs，也可以消耗新生的轉(zhuǎn)錄本。

針對(duì)以上問(wèn)題，銳博生物獨(dú)家推出Ribo^TM lncRNA Smart Silencer系列l(wèi)ncRNA抑制劑。對(duì)于細(xì)胞質(zhì)定位、細(xì)胞核定位、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核共定位以及定位不確定的lncRNA/基因，均可使用Smart Silencer進(jìn)行干擾實(shí)驗(yàn)，在正常細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率條件下，可實(shí)現(xiàn)lncRNA/基因核內(nèi)和胞質(zhì)的全方位抑制。

Smart Silencer是由3條siRNA和3條ASO混合組成的即用型特異性lncRNA/基因抑制劑，可通過(guò)多種抑制機(jī)制獲得更高的沉默效果。相比普通siRNA具有更高靈敏度和抑制效率，是進(jìn)行l(wèi)ncRNA/基因功能缺失性研究的理想選擇。

哪種lncRNA/mRNA沉默產(chǎn)品適合您？

因此，對(duì)于lncRNA功能缺失性研究更多客戶傾向于選擇Smart Silencer，相關(guān)研究成果更是發(fā)表在Science（IF41.058）、Science translational medicine（IF16.71）、Immunity（IF19.734）等國(guó)際頂級(jí)期刊。

1. Smart Silencer顯著抑制細(xì)胞質(zhì)靶標(biāo)

Wang P, et al. Science, 2017, 358(6366): 1051-1055.

FISH實(shí)驗(yàn)證實(shí)lncRNA-ACOD1定位于細(xì)胞質(zhì)，針對(duì)lncRNA-ACOD1 LOC105370268位點(diǎn)設(shè)計(jì)合成Smart Silencer，并轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)lncRNA-ACOD1 RNA的表達(dá)被顯著抑制。

2. Smart Silencer顯著抑制核內(nèi)外靶標(biāo)

Meng Q, et al. Science translational medicine, 2018, 10(472): eaat6912.

核質(zhì)分離顯示：與細(xì)胞核lncRNA NEAT1和細(xì)胞質(zhì)lncRNA OIP5-AS1相比，DGCR5是細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)共定位。將DGCR5 Silencer轉(zhuǎn)染hNPCs細(xì)胞可顯著敲低細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的DGCR5表達(dá)。

Liu J, et al. Immunity, 2019, 50(3): 600-615. e15.

核質(zhì)分離與FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)lnc-Dpf3主要位于細(xì)胞質(zhì)，小部分位于細(xì)胞核。將lnc-Dpf3 Silencer轉(zhuǎn)染mDCs細(xì)胞可顯著敲低細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中的lnc-Dpf3表達(dá)，從而增加CCR7介導(dǎo)的mDC遷移。

3. Smart Silencer顯著抑制細(xì)胞核靶標(biāo)

Liu Y, et al. Cancer science, 2018, 109(7): 2188-2198.

RNA FISH實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NEAT1定位于細(xì)胞核，將NEAT1 silencer轉(zhuǎn)染SKOV3和HO8910細(xì)胞抑制NEAT1的表達(dá)，可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

4. Smart Silencer顯著抑制定位不確定靶標(biāo)

Li H, et al. Cardiovascular research, 2018, 114(5): 747-758.

對(duì)于定位不確定的lncRNAs，將RP11-544D21.2和XLOC_014288 siRNA (smart silencer)轉(zhuǎn)染HCMs細(xì)胞可分別顯著敲低RP11-544D21.2和XLOC_014288的表達(dá)水平，并且RP11-544D21.2敲低減少了HUVEC的管形成和遷移。

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Smart Silencer-lncRNA/基因

Smart Silencer對(duì)照

小知識(shí)：LncRNAs分類知多少

lncRNA基因座廣泛分布于整個(gè)基因組中，根據(jù)其基因組位置可分為基因間lncRNA（lincRNAs）和基因內(nèi)lncRNAs。

1、基因間lncRNAs位于其他基因之間，可以由獨(dú)立或雙向啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄而來(lái)。如果在頭對(duì)頭（5′-to-5’）方向上相鄰兩個(gè)基因TSSs之間的距離≤2kb，則將基因間lncRNAs的啟動(dòng)子定義為雙向啟動(dòng)子。

2、基因內(nèi)lncRNAs分為正義和反義lncRNAs，這取決于lncRNAs相對(duì)于其交叉基因的轉(zhuǎn)錄方向。正義和反義lncRNAs又包含以下類別：

• Internal：當(dāng)lncRNA嵌入另一個(gè)基因的基因體內(nèi)并與其外顯子重疊時(shí)；
• Intronic：當(dāng)lncRNA完全位于另一個(gè)基因的內(nèi)含子內(nèi)時(shí)；
• Overlapping：當(dāng)另一個(gè)基因完全位于lncRNA的內(nèi)含子內(nèi)時(shí)。

此外，如果lncRNAs與基因起始位點(diǎn)之間的距離≤2kb，則與其他基因在頭對(duì)頭方向交叉的反義lncRNAs啟動(dòng)子也被認(rèn)為是雙向的。

來(lái)源：銳博生物