2024年11月22日，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院、北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心、核糖核酸北京研究中心高寧課題組在The EMBO Journal發(fā)表了題為“Structural insight into Okazaki fragment maturation mediated by PCNA-bound FEN1 and RNaseH2”的研究論文，對(duì)含有PCNA的內(nèi)源相關(guān)復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)研究，獲得了兩組PCNA復(fù)合物（PCNA-FEN1、PCNA-FEN1-RNaseH2）的結(jié)構(gòu)，為理解岡崎片段成熟的后期步驟提供了一系列的結(jié)構(gòu)快照。

論文截圖

真核生物DNA復(fù)制在復(fù)雜的染色質(zhì)環(huán)境下進(jìn)行，與多種分子生物學(xué)過程互相協(xié)調(diào)，例如DNA復(fù)制與修復(fù)的偶聯(lián)以及DNA復(fù)制與新生核小體組裝的偶聯(lián)等^1,2。PCNA（Proliferating cell nuclear antigen）作為DNA復(fù)制體不可缺少的輔助蛋白，在DNA復(fù)制中結(jié)合各種DNA聚合酶以賦予其持續(xù)合成的能力，也可以將多種因子募集到DNA復(fù)制、修復(fù)等DNA代謝事件發(fā)生的位點(diǎn)，并促進(jìn)相應(yīng)的生物學(xué)反應(yīng)，是DNA代謝的中心樞紐之一^3,4。與PCNA相互作用的蛋白超過兩百多種，包括DNA復(fù)制相關(guān)蛋白（Pol δ、Pol ε、Pol η、Pol κ、FEN1、LIG1等）、解旋酶（WRN、BLM、RECQ5等）、DNA修復(fù)蛋白（MSH3、MSH6、XPG、FANCM等）、表觀遺傳因子（CAF-1、DNMT1、p300、HDAC1等）及參與細(xì)胞周期調(diào)控、凋亡等過程的一些蛋白分子，它們都是通過自身保守的PIP box（PCNA-interacting protein box）或PIP-like基序結(jié)合PCNA⁴。

真核生物PCNA是環(huán)繞雙鏈DNA的同源三聚體，每個(gè)單體都包含一個(gè)PIP box結(jié)合位點(diǎn)，因此一個(gè)PCNA環(huán)可以至多結(jié)合3個(gè)含有PIP box的蛋白因子。領(lǐng)域內(nèi)認(rèn)為PCNA的協(xié)調(diào)功能是通過“工具帶，toolbelt”的形式實(shí)現(xiàn)，即PCNA同時(shí)結(jié)合處于上下游過程的不同的酶，以提高DNA代謝相關(guān)事件的整體效率⁴。一個(gè)具有代表性的例子是DNA復(fù)制過程中的滯后鏈岡崎片段的加工成熟，參與這一過程的所有具有催化活性的酶都與PCNA有相互作用，包括Pol δ、RNaseH2、FEN1、EXO1、PIF1、DNA2以及LIG1^4—6。參與引物去除的主要因子是Pol δ、RNaseH2和FEN1，RNaseH2作為RNA核酸酶去除由Pol α與引物酶復(fù)合物所合成的RNA-DNA引物中的RNA；DNA聚合酶Pol δ在完成滯后鏈上的新生DNA鏈的延伸之后，會(huì)進(jìn)行鏈置換反應(yīng)，繼續(xù)向前合成將臨近岡崎片段中的引物頂起，形成5′-flap DNA結(jié)構(gòu)；FEN1作為結(jié)構(gòu)特異性的DNA核酸內(nèi)切酶結(jié)合并切割5′-flap DNA；通過這一系列步驟，保真度較差的DNA引物及RNA引物得以去除。領(lǐng)域前期通過體外重組的方式，已經(jīng)獲得了PCNA-FEN1-Pol δ、PCNA-FEN1-LIG1復(fù)合物，對(duì)它們的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了表征，部分地驗(yàn)證了PCNA作為工具帶的分子角色^7,8。然而很多重要的機(jī)制性的問題還未得到解答，例如PCNA如何特異性地選擇并協(xié)調(diào)參與同一DNA代謝事件的不同蛋白因子；同時(shí)結(jié)合在PCNA上的蛋白因子之間是否進(jìn)行相互的變構(gòu)調(diào)節(jié)等。

課題組以PCNA作為誘餌蛋白，首先建立了一套從染色質(zhì)中快速純化PCNA內(nèi)源復(fù)合物的方法，得到了一系列含有PCNA且參與DNA復(fù)制、核小體組裝、DNA修復(fù)等過程的內(nèi)源復(fù)合物。

圖1 PCNA內(nèi)源相關(guān)復(fù)合物的獲得

課題組結(jié)合冷凍電鏡單顆粒三維重構(gòu)技術(shù)解析了兩套復(fù)合物PCNA-FEN1與PCNA-FEN1-RNaseH2不同狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)。其中PCNA-FEN1復(fù)合物中FEN1處于催化后狀態(tài)，5′-flap DNA被切割但尚未離開FEN1的酶活中心，表明FEN1的5′-flap DNA產(chǎn)物釋放在細(xì)胞內(nèi)是限速步驟。

圖2 PCNA-FEN1復(fù)合物中5′-flap DNA已被酶切

該研究在PCNA-FEN1-RNaseH2復(fù)合物中，發(fā)現(xiàn)FEN1與RNaseH2分別結(jié)合PCNA的不同亞基，證實(shí)了PCNA工具帶的功能。對(duì)不同狀態(tài)的PCNA-FEN1-RNaseH2復(fù)合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)RNaseH2始終結(jié)合在FEN1催化位點(diǎn)上游固定的雙鏈DNA區(qū)域，并且此區(qū)域不包含任何未去除的RNA殘基，這表明同時(shí)結(jié)合PCNA的FEN1與RNaseH2存在一種未被認(rèn)識(shí)到的功能上的耦合。因?yàn)?′-flap DNA是聚合酶Pol δ繼續(xù)向前合成進(jìn)行鏈置換的產(chǎn)物，其核苷酸序列與其上游雙鏈DNA序列一致，所以在細(xì)胞中5′-flap DNA很可能侵入上游的雙鏈DNA，產(chǎn)生3′-flap DNA，一旦3′-flap長(zhǎng)度大于1nt，F(xiàn)EN1將無法切割5′-flap DNA。然而，當(dāng)RNaseH2結(jié)合在5′-flap DNA上游雙鏈DNA時(shí)，由于空間位阻的存在，5′-flap DNA無法進(jìn)行鏈入侵，大幅降低了5′-flap DNA轉(zhuǎn)化形成3′-flap DNA的概率，因此RNaseH2可能通過維持DNA底物的特定構(gòu)象以促進(jìn)FEN1 5′-flap DNA的酶切效率。

圖3 人源PCNA-FEN1-RNase H2復(fù)合物結(jié)構(gòu)

此外，結(jié)構(gòu)分析表明在PCNA-FEN1-RNaseH2復(fù)合物中RNaseH2蛋白通過RNaseH2A亞基結(jié)合PCNA，而不是之前報(bào)道的RNaseH2B PIP box結(jié)合PCNA，序列分析鑒定到RNaseH2A亞基中一個(gè)新的PIP box，通過體外生化實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了RNaseH2A及RNaseH2B亞基的PIP box都可以結(jié)合PCNA。結(jié)合免疫熒光電鏡的成像實(shí)驗(yàn)，表明RNaseH2A PIP box與RNaseH2B PIP box在不同的生理學(xué)過程中發(fā)揮功能。

本研究表明PCNA在細(xì)胞內(nèi)可以作為工具帶同時(shí)結(jié)合多個(gè)蛋白因子。之前的模型認(rèn)為同時(shí)結(jié)合PCNA的蛋白是按照順序發(fā)揮功能，一個(gè)酶發(fā)揮完功能后與DNA解離，釋放出DNA底物以供另一個(gè)酶結(jié)合；與之前的模型不同，在PCNA-FEN1-RNaseH2復(fù)合物結(jié)構(gòu)中，F(xiàn)EN1與RNaseH2穩(wěn)定結(jié)合同一個(gè)DNA底物，RNaseH2可能通過對(duì)底物DNA的構(gòu)象調(diào)控來促進(jìn)FEN1的酶切效率。這表明細(xì)胞內(nèi)同時(shí)結(jié)合PCNA的不同蛋白因子間可能會(huì)對(duì)它們酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)行互相調(diào)控。RNaseH2除了作為RNA核酸酶參與岡崎片段引物RNA的去除外，本研究發(fā)現(xiàn)了RNaseH2的另一個(gè)可能的新功能，即以不依賴于核酸酶活性的形式作為雙鏈DNA結(jié)合蛋白來調(diào)節(jié)FEN1的5′-flap DNA酶切功能。

圖4 RNaseH2在岡崎片段成熟過程中發(fā)揮作用的模型

高寧為本論文的通訊作者。生命科學(xué)學(xué)院2020級(jí)博士研究生田宇輝為本論文第一作者。生命科學(xué)學(xué)院研究員李寧寧在實(shí)驗(yàn)方法探究及結(jié)構(gòu)計(jì)算方面提供了幫助。生命科學(xué)學(xué)院教授李晴為該論文提供了支持與幫助。本研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金和昌平實(shí)驗(yàn)室的支持。北京大學(xué)冷凍電鏡平臺(tái)、昌平實(shí)驗(yàn)室冷凍電鏡平臺(tái)、北京大學(xué)高性能計(jì)算平臺(tái)、生命科學(xué)學(xué)院儀器中心及國(guó)家蛋白質(zhì)基礎(chǔ)設(shè)施（北大分平臺(tái)）對(duì)本項(xiàng)目提供了重要的技術(shù)支持。

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來源：北京大學(xué)