以對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行環(huán)化、索烴化、打結(jié)等拓?fù)涓脑鞛榇淼牡鞍踪|(zhì)拓?fù)涔こ淌且环N重要的調(diào)控蛋白質(zhì)性質(zhì)的手段。近年來，基于可基因編碼的蛋白質(zhì)纏結(jié)基元和反應(yīng)基元的“組裝-反應(yīng)協(xié)同”理念，發(fā)展了包括被動(dòng)模板、主動(dòng)模板、原位串聯(lián)反應(yīng)等多種拓?fù)涞鞍缀铣煞椒?。由于環(huán)化和機(jī)械互鎖帶來的構(gòu)象限制效應(yīng)，索烴化蛋白質(zhì)具有抗熱變性、抗化學(xué)變性、抗酶解、抗聚集等穩(wěn)定化特征，具有重要的實(shí)用意義。但是，目前構(gòu)建的大部分蛋白質(zhì)索烴其纏結(jié)結(jié)構(gòu)是由額外的纏結(jié)基元介導(dǎo)的，產(chǎn)物中往往存在冗余的序列，其性能也易受額外基元影響，不便于研究和闡明構(gòu)效關(guān)系。因此，單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)索烴的構(gòu)建至關(guān)重要，有助于系統(tǒng)性地探究拓?fù)鋵?duì)于構(gòu)效關(guān)系的影響，并拓展蛋白質(zhì)索烴的實(shí)際應(yīng)用。

近期，化學(xué)與分子工程學(xué)院張文彬教授課題組在單結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)索烴的設(shè)計(jì)和合成方面取得重要進(jìn)展?；趯?duì)綠色熒光蛋白（GFP）折疊結(jié)構(gòu)的分析和理解，他們將組成β-桶狀結(jié)構(gòu)的11個(gè)β折疊片的連接關(guān)系進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，人為引入纏結(jié)關(guān)系，設(shè)計(jì)了單結(jié)構(gòu)域綠色熒光蛋白索烴（圖1），并實(shí)現(xiàn)了細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外的可控合成（圖2），發(fā)現(xiàn)其相比于野生型具有更好的熱回復(fù)性（圖3）。

圖1. 單結(jié)構(gòu)域綠色熒光蛋白索烴的設(shè)計(jì)。a，野生型綠色熒光蛋白（PDB：2B3P）的卡通圖、拓?fù)鋱D以及基因卡帶。b，單結(jié)構(gòu)域綠色熒光蛋白索烴的卡通圖、拓?fù)鋱D以及基因卡帶。新引入的連接鏈用深紅色和深綠色的加粗線條表示，組成索烴的兩個(gè)環(huán)分別由紅色和綠色表示

首先，利用“組裝-反應(yīng)”協(xié)同，作者發(fā)展了胞內(nèi)組裝、胞外環(huán)化的兩步合成法，通過綠色熒光蛋白準(zhǔn)輪烷中間體實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白索烴的合成。值得注意的是，胞外環(huán)化反應(yīng)的過程中，準(zhǔn)輪烷中間體可以通過分子內(nèi)反應(yīng)形成二索烴或分子間反應(yīng)形成三索烴，二者可以通過體積排阻色譜高效分離（圖2a）。這種設(shè)計(jì)和構(gòu)建單結(jié)構(gòu)域索烴的方法還可以拓展到具有類似折疊結(jié)構(gòu)的其他熒光蛋白中。作者將類似的單結(jié)構(gòu)域索烴構(gòu)建方法進(jìn)一步應(yīng)用在來自香菇珊瑚的紅色熒光蛋白（mCherry），來自羽珊瑚的綠色熒光蛋白（mWasabi）和來自于維多利亞水母的黃色熒光蛋白（YPet）中，證實(shí)了該方法對(duì)熒光蛋白家族具有一定的普適性，成功構(gòu)建了單結(jié)構(gòu)域熒光蛋白索烴家族。這種單結(jié)構(gòu)域綠色熒光蛋白索烴的環(huán)區(qū)還容許通過基因工程的手段模塊化地融合多種目標(biāo)蛋白質(zhì)，從而實(shí)現(xiàn)融合蛋白索烴的構(gòu)建（圖2b）。作者還進(jìn)一步證實(shí)，通過應(yīng)用不同的正交分離型內(nèi)含肽反應(yīng)對(duì)，可以實(shí)現(xiàn)單結(jié)構(gòu)域熒光蛋白索烴的細(xì)胞內(nèi)合成。

圖2.a，綠色熒光蛋白索烴的合成。b，融合蛋白索烴的合成

作者探究了索烴化對(duì)于蛋白質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的影響。在高溫加熱和冷卻復(fù)性之后，綠色熒光蛋白索烴的熒光可以完全恢復(fù)，遠(yuǎn)優(yōu)于其環(huán)狀對(duì)照和線性對(duì)照的熒光恢復(fù)情況，具有良好的熱回復(fù)性。這一性質(zhì)在融合蛋白索烴中也得以保持（圖3a）。此外，索烴的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也為融合蛋白索烴中的功能蛋白提供了一定的構(gòu)象限制，有效提升了功能蛋白的熱回復(fù)性、熱穩(wěn)定性以及機(jī)械穩(wěn)定性（圖3b）。

圖3.a, 索烴化能夠有效提升蛋白質(zhì)的熱回復(fù)性。b, 索烴化能夠提供額外的構(gòu)象限制，提升功能蛋白的熱回復(fù)性、熱穩(wěn)定性以及機(jī)械穩(wěn)定性

綜上所述，作者將綠色熒光蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)基元重新接線，結(jié)合兩步合成法，實(shí)現(xiàn)了綠色熒光蛋白單結(jié)構(gòu)域索烴的構(gòu)建。這種方法不僅可以拓展到熒光蛋白家族的其他變體，實(shí)現(xiàn)熒光蛋白索烴家族的構(gòu)建，還可以耐受其他功能蛋白的插入，作為索烴化的模板實(shí)現(xiàn)融合蛋白索烴的構(gòu)建。這種索烴化的方法更好地實(shí)現(xiàn)了不同結(jié)構(gòu)域之間的耦合和協(xié)同，在工業(yè)酶工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有廣泛的潛在應(yīng)用價(jià)值。

該研究近期在線發(fā)表于Nat. Commun.，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生曲志宇為該論文第一作者。北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院博士生王宇翔，博士后方晶、孫軼斌、劉雅杰、吳文豪也為本工作作出了貢獻(xiàn)。張文彬?yàn)橥ㄓ嵶髡?。該工作得到?guó)家自然科學(xué)基金、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目、科技部、北京分子科學(xué)國(guó)家研究中心創(chuàng)新項(xiàng)目的支持。

原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-023-39233-7

來源：北京大學(xué)