異基因造血干細(xì)胞移植（allo-HSCT）是目前治療血液系統(tǒng)惡性腫瘤的有效手段。但移植后合并癥移植物抗宿主疾?。℅raft-versus-host disease，GVHD）是造成移植后患者死亡的主要原因之一，嚴(yán)重影響了患者的生存及生活質(zhì)量。GVHD可分為急性GVHD（aGVHD）和慢性GVHD（cGVHD），aGVHD在造血干細(xì)胞移植患者中的發(fā)生率為25%—55%，而cGVHD在患者中的發(fā)生率約為40%。無論是aGVHD還是cGVHD患者，對(duì)于一線激素治療無效的患者，目前均缺乏有效的二線治療藥物。而激素治療無效的aGVHD患者長(zhǎng)期生存率較低，僅為5%—30%。因此，尋找aGVHD有效預(yù)防及干預(yù)靶點(diǎn)是亟待解決的科學(xué)和臨床問題。

G-CSF（Granulocyte colony-stimulating factor）是粒細(xì)胞刺激因子，可以刺激骨髓中髓系祖細(xì)胞增殖并向成熟粒細(xì)胞分化發(fā)育。對(duì)健康供者給予G-CSF預(yù)處理，不僅可以將骨髓中CD34+造血干細(xì)胞動(dòng)員至外周血，同時(shí)G-CSF還可以通過調(diào)控T細(xì)胞以及APCs（抗原提呈細(xì)胞）的活性和功能而進(jìn)一步調(diào)控免疫系統(tǒng)。在臨床研究及小鼠GVHD模型中均表明，G-CSF可通過抑制T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)產(chǎn)生T細(xì)胞免疫耐受從而降低aGVHD的發(fā)生。然而，G-CSF誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受的分子機(jī)制尚未有明確研究。

2022年5月18日，北京大學(xué)血液病研究所所長(zhǎng)、國家血液系統(tǒng)疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心主任黃曉軍教授，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院李程研究員，北京大學(xué)血液病研究所常英軍教授合作，在Advanced Science期刊發(fā)表了“Multiomics Analysis Identifies SOCS1 as Restraining T Cell Activation and Preventing Graft-Versus-Host Disease”的研究論文。在本項(xiàng)研究中，研究人員利用多組學(xué)測(cè)序手段RNA-seq、ATAC-seq、Hi-C等技術(shù)，分析了G-CSF動(dòng)員前、后健康供者骨髓來源的CD3+CD4+和CD3+CD8+ T細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組、染色質(zhì)開放性及三維基因組結(jié)構(gòu)變化（圖1A）。多組學(xué)分析提示，G-CSF動(dòng)員后的T細(xì)胞中正向調(diào)控T細(xì)胞相關(guān)活化基因的表達(dá)水平下調(diào)，負(fù)向調(diào)控T細(xì)胞增殖及活化相關(guān)信號(hào)通路表達(dá)上調(diào)（圖1B）。ATAC-seq分析也表明，T細(xì)胞活化相關(guān)基因所在染色質(zhì)區(qū)域在G-CSF動(dòng)員后的T細(xì)胞中染色質(zhì)開放性下降（圖1C）。

圖1. G-CSF動(dòng)員前后T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組及染色質(zhì)可及性變化

通過整合RNA-seq，ATAC-seq及Hi-C的多組學(xué)數(shù)據(jù)分析，研究人員發(fā)現(xiàn)SOCS1是G-CSF動(dòng)員后表達(dá)水平上調(diào)最為顯著的基因，而轉(zhuǎn)錄因子STAT3可能是直接調(diào)控SOCS1表達(dá)的上游因子（圖2A）。進(jìn)一步整合分析原代T細(xì)胞中增強(qiáng)子信號(hào)（H3K27ac）以及STAT3的染色質(zhì)結(jié)合（CUT&Tag）數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，G-CSF可能通過重構(gòu)SOCS1基因編碼區(qū)的染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)上調(diào)SOCS1表達(dá)水平。在G-CSF動(dòng)員后的T細(xì)胞中SOCS1的基因編碼區(qū)附近，STAT3的結(jié)合重構(gòu)染色質(zhì)環(huán)，促使SOCS1啟動(dòng)子區(qū)域與上游的增強(qiáng)子區(qū)域互作加強(qiáng)，而由CTCF介導(dǎo)的SOCS1啟動(dòng)子區(qū)域與下游的異染色質(zhì)區(qū)域互作水平降低，從而上調(diào)了SOSC1的表達(dá)水平（圖2B）。

圖2. G-CSF通過STAT3介導(dǎo)的染色質(zhì)環(huán)重構(gòu)上調(diào)T細(xì)胞SOCS1表達(dá)水平

進(jìn)一步，為了驗(yàn)證SOCS1在T細(xì)胞活化中的調(diào)控作用，研究人員首先利用慢病毒在體外人原代T細(xì)胞中過表達(dá)了SOCS1基因，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞增殖能力顯著降低，同時(shí)T細(xì)胞耗竭相關(guān)分子TIGIT表達(dá)顯著上調(diào)。接著構(gòu)建了T細(xì)胞特異性敲除Socs1的轉(zhuǎn)基因小鼠，從體內(nèi)水平探索SOCS1對(duì)T細(xì)胞的調(diào)控作用。T細(xì)胞缺失Socs1后增殖能力顯著增強(qiáng)，促炎因子IFN-γ分泌水平顯著增多。此外，在由供鼠C57BL/6移植受鼠BALB/c建立的GVHD小鼠模型中，接受Socs1-/-T細(xì)胞移植的GVHD受鼠相較于接受野生型T細(xì)胞移植的受鼠生存期顯著縮短，同時(shí)在肝、肺、小腸及大腸等組織有更明顯的淋巴細(xì)胞侵潤(rùn)導(dǎo)致的組織損傷。研究人員進(jìn)一步利用G-CSF或PBS預(yù)處理的供鼠移植受鼠建立GVHD模型，探索T細(xì)胞缺失Socs1后是否影響G-CSF對(duì)GVHD受鼠的保護(hù)作用。在野生型組，供鼠經(jīng)過G-CSF處理后相較于PBS處理組顯著延長(zhǎng)了GVHD小鼠的生存期。而在Socs1-/-組，供鼠經(jīng)過G-CSF處理后的GVHD受鼠生存期與PBS處理組無顯著差異。以上結(jié)果提示，T細(xì)胞缺失Socs1后G-CSF對(duì)GVHD小鼠的保護(hù)作用消失，證明G-CSF在體內(nèi)通過上調(diào)T細(xì)胞中SOCS1水平從而誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入免疫耐受態(tài)，從而降低GVHD損傷。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，SOCS1不僅對(duì)CSF3R/JAK2/STAT3信號(hào)通路有抑制作用，同時(shí)對(duì)NLRP3炎癥小體信號(hào)通路也具有抑制作用。利用SOCS1蛋白功能域擬合肽段體外處理人原代T細(xì)胞后，可顯著降低T細(xì)胞增殖能力，并抑制STAT3的磷酸化水平，這一結(jié)果提示，SOCS1由STAT3激活后會(huì)負(fù)反饋性抑制STAT3的活化。此外，研究人員還通過小規(guī)模臨床隊(duì)列發(fā)現(xiàn)，發(fā)生GVHD的患者與移植后同期未發(fā)生GVHD的患者相比，T細(xì)胞中SOCS1的表達(dá)水平顯著降低。

綜上，研究人員通過多組學(xué)分析并結(jié)合體內(nèi)及體外功能實(shí)驗(yàn)，完善了G-CSF誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受的分子機(jī)制模型：G-CSF通過與T細(xì)胞表面受體CSF3R結(jié)合，激活STAT3?；罨腟TAT3進(jìn)入細(xì)胞核，通過重塑SOCS1基因編碼區(qū)染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)，上調(diào)SOCS1的表達(dá)水平。高水平SOCS1不僅可以負(fù)反饋抑制CSF3R/STAT3通路，同時(shí)還可抑制NLRP3炎癥小體信號(hào)通路，從而抑制T細(xì)胞增殖及炎癥因子分泌，誘導(dǎo)T細(xì)胞進(jìn)入免疫耐受態(tài)，降低GVHD損傷（圖3）。此研究揭示了SOCS1在抑制T細(xì)胞活化及降低GVHD中的重要調(diào)控作用，為臨床進(jìn)一步干預(yù)及預(yù)防GVHD提供了新的潛在靶點(diǎn)。

圖3. G-CSF誘導(dǎo)T細(xì)胞免疫耐受分子調(diào)控機(jī)制模式圖

北京大學(xué)人民醫(yī)院助理研究員郭惠東，北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士生李瑞風(fēng)（現(xiàn)清華大學(xué)博士后）為本文共同第一作者。黃曉軍、李程、常英軍為本文的共同通訊作者。

來源：北京大學(xué)