人類受精卵形成初期，自身基因不表達，而需要依賴卵子攜帶的母源因子執(zhí)行細胞功能。隨著受精卵的不斷分裂，當?shù)竭_8細胞期時，卵子來源的母源因子逐漸降解消除，而胚胎自身的基因被激活，個體開始依賴自身的基因表達完成后續(xù)發(fā)育。8細胞期發(fā)生的該過程被稱作合子基因組激活，是胚胎發(fā)育的關(guān)鍵節(jié)點，該過程的異?？芍苯訉?dǎo)致胚胎發(fā)育的停止。因此，研究8細胞期細胞調(diào)控機制對于保證良好的早期胚胎發(fā)育有重要意義。

建立人類8細胞樣細胞（8CLC）體外誘導(dǎo)的平臺

我們在前期通過篩選，建立了新型的人類8CLC體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基e4CL和兩種不同的8CLC誘導(dǎo)方法：直接誘導(dǎo)法和階段誘導(dǎo)法（圖1a）。誘導(dǎo)后獲得的全能性細胞（8CLC）比例為10-15 %。我們構(gòu)建了可用于篩選純化8CLC的報告基因細胞系，該細胞系能夠幫助我們對大量純化8CLC進行功能和機制研究。為了測試此誘導(dǎo)方法產(chǎn)生的8CLC反應(yīng)8C胚胎細胞的相似度，我們將階段誘導(dǎo)法獲得的8CLC與體內(nèi)胚胎數(shù)據(jù)進行了整合（圖1b）。誘導(dǎo)的細胞逐漸從類似胚胎第7天（E7）的狀態(tài)回到類似胚胎第5天（E5），當誘導(dǎo)結(jié)束時，細胞與胚胎第三天（E3，即8細胞期）類似（圖1b）。我們還從染色質(zhì)開放狀態(tài)、DNA甲基化修飾等多個角度驗證了8CLC和8細胞期胚胎的相似性。

圖1 人全能性8CLC的誘導(dǎo)方法及與胚胎發(fā)育時期的比較

鑒定8CLC轉(zhuǎn)換中的分析調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

為了探究8CLC的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，研究人員基于單細胞測序數(shù)據(jù)，使用加權(quán)基因相關(guān)網(wǎng)絡(luò)分析（scWGCNA）定義了共表達的基因模塊和差異表達的中樞基因。該分析揭示了不同細胞狀態(tài)的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（GRN）。8CLC GRN的核心參與者包括DPPA3、TPRX1、ZSCAN4和DUXA等（圖2a）。這些GRN中許多基因的功能在很大程度上是未知的，反映了我們迄今為止對人類早期發(fā)育階段和全能性的有限了解。

此外，研究人員比較了同一時間點8CLC與其他細胞（非8CLC）中的差異表達基因（DEG）。8CLC高表達基因中包含了預(yù)測出的8CLC GRN關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，包括DPPA3、TPRX1、ZSCAN4、DUXA和ZNF280A。研究人員對其中表達差異最顯著的DPPA3和TPRX1進行了功能實驗驗證。干擾DPPA3的表達抑制8CLC的誘導(dǎo)（圖2b），且該作用是由DNA甲基化水平上調(diào)引起的。同時，敲除TPRX1也能顯著抑制8CLC的誘導(dǎo)（圖2c），說明DPPA3和TPRX1是8CLC狀態(tài)建立的關(guān)鍵調(diào)控因子。

通過這部分內(nèi)容，研究人員提供了8CLC轉(zhuǎn)換的分子路線圖，并且剖析了其中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，鑒定出DPPA3和TPRX1為誘導(dǎo)8CLC的兩個核心因子。見圖2。

圖2 8CLC基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和核心調(diào)控因子DPPA3、TPRX1的功能驗證

評估8CLC的分化潛能

利用純化的8CLC，研究團隊從滋養(yǎng)層細胞分化能力、模擬人類囊胚形成能力和畸胎瘤分化過程中產(chǎn)生胚外組織細胞的能力等方面系統(tǒng)評估了8CLC的分化潛能。

分選后的8CLC在3D培養(yǎng)條件下，可以自發(fā)形成類似人胚胎囊胚階段的結(jié)構(gòu)（稱為類囊胚）。利用囊胚內(nèi)細胞團標記蛋白OCT4 和滋養(yǎng)外胚層標記蛋白GATA2進行免疫熒光，驗證了8CLC產(chǎn)生的類囊胚在標記蛋白上與囊胚的相似性（圖3a）。此外，我們對該類囊胚結(jié)構(gòu)進行了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析結(jié)果顯示全能性8CLC產(chǎn)生的類囊胚具有上胚層、下胚層和滋養(yǎng)外胚層，與胚胎構(gòu)成類似（圖3b,c）。

畸胎瘤常被用來評估多能干細胞在體內(nèi)的發(fā)育潛能，也是研究譜系發(fā)育的良好模型。為了檢測8CLC的發(fā)育潛能，我們利用不同多能性狀態(tài)的細胞和分選出的8CLC產(chǎn)生畸胎瘤，并進行了基于DNBelab C4平臺的高通量單細胞轉(zhuǎn)錄組測序。實驗共得到了227,598 個單細胞，注釋出24種細胞類型。結(jié)果顯示，分選的8CLC來源的畸胎瘤包含胚胎外滋養(yǎng)細胞譜系和更豐富的其他譜系如生血內(nèi)皮細胞和免疫細胞等（圖3d）。

總的來說，8CLC具有胚胎的三胚層和胚外的滋養(yǎng)層發(fā)育潛能，即具有全能性，在功能層面上與人類8細胞期細胞的分化能力契合，是研究人類早期胚胎發(fā)育的可靠材料。本文涉及的所有實驗均符合國際倫理規(guī)范的要求，并經(jīng)過了嚴格的倫理審查。

圖3 利用類囊胚模型和畸胎瘤實驗驗證8CLC全能性發(fā)育潛能

該研究項目填補了體外人8細胞期胚胎樣細胞的空白，與人多能性狀態(tài)的細胞相比，全能性的8CLC具有更好的發(fā)育和分化能力等眾多優(yōu)勢。該成果對早期胚胎發(fā)育相關(guān)的基礎(chǔ)研究提供了新的體外研究體系，有助于我們理解早期胚胎發(fā)育過程及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)與疾病發(fā)生的關(guān)系，為防治出生缺陷及多種發(fā)育源性疾病提供理論基礎(chǔ)和可行路徑；同時也為全能性細胞用于細胞治療和疾病建模提供了更好的模型選擇?？蒲袌F隊將會進一步建立高效率、高純度的人8CLC全能性細胞生產(chǎn)平臺，并利用全能性細胞制備功能性細胞和藥物篩選平臺。

Md. Abdul Mazid、Carl Ward、駱志偉和劉傳宇為該論文的共同第一作者，Miguel A. Esteban、李文娟、劉龍奇和Md. Abdul Mazid為論文的共同通訊作者。