3月12日，中國科學(xué)院北京生命科學(xué)研究院研究員趙方慶團隊在Nature Biotechnology上發(fā)表了題為Comprehensive profiling of circular RNAs with nanopore sequencing and CIRI-long的論文，研究內(nèi)容為高效測定環(huán)形RNA全長轉(zhuǎn)錄本的實驗和計算方法。該研究主要是利用隨機引物對環(huán)形RNA進行的滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄擴增，而后應(yīng)用納米孔測序技術(shù)對環(huán)形RNA的全長序列進行直接測序，并使用開發(fā)的CIRI-long算法識別長測序讀段中的環(huán)形RNA序列并進行全長重構(gòu)。實驗結(jié)果表明，與傳統(tǒng)的環(huán)形RNA二代測序技術(shù)相比，該方法將環(huán)形RNA檢測靈敏度提升了20倍，并可實現(xiàn)對不同長度（<100bp-5kb）的環(huán)形RNA全長序列的無偏識別，大幅提升了環(huán)形轉(zhuǎn)錄本的重構(gòu)能力，為其功能研究提供了重要的實驗方法和計算工具。

環(huán)形RNA是一類在真核生物中廣泛存在的具有特殊環(huán)狀結(jié)構(gòu)的RNA分子。研究表明，在生物體內(nèi)，環(huán)形RNA主要通過其序列特征，發(fā)揮miRNA海綿、RBP海綿及翻譯短肽等重要的生物學(xué)功能。因而環(huán)形RNA的全長序列確定是進行環(huán)形RNA功能研究的重要基礎(chǔ)。由于環(huán)形RNA的內(nèi)部序列與線性mRNA分子高度相似，在數(shù)據(jù)中很難區(qū)分來自環(huán)形RNA和線性RNA分子的讀段。研究方法對于環(huán)形RNA結(jié)構(gòu)的識別能力主要被二代測序的讀長所限制，對于長度較長（>500bp）的環(huán)形RNA分子，仍缺少有效的全長重構(gòu)手段。

針對這一問題，研究團隊構(gòu)建并優(yōu)化環(huán)形RNA建庫流程，使用隨機引物對環(huán)形RNA進行滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄擴增，結(jié)合片段長度篩選（~1kb），針對長度更長的目標(biāo)cDNA片段進行富集，最后使用納米孔測序技術(shù)，實現(xiàn)了對目標(biāo)環(huán)形RNA的全長序列進行直接測定。同時，研究人員進一步開發(fā)了CIRI-long算法，識別納米孔測序數(shù)據(jù)中的環(huán)形RNA結(jié)構(gòu)，并使用偏序比對算法，校正納米孔測序帶來的測序錯誤。隨后，CIRI-long基于基因注釋和剪接信號信息，提供單一樣本內(nèi)和多樣本間結(jié)果的整合與校正方法，實現(xiàn)了環(huán)形RNA的準(zhǔn)確識別和全長重構(gòu)。

為了評估CIRI-long方法的準(zhǔn)確性和效率，研究人員利用模擬數(shù)據(jù)和多次實驗重復(fù)，綜合評估CIRI-long結(jié)果，發(fā)現(xiàn)該方法具有較高的靈敏度，且與實驗結(jié)果保持了高度的一致性。同時，結(jié)合二代測序結(jié)果及公共數(shù)據(jù)庫的全面分析，表明CIRI-long可有效地對高表達環(huán)形RNA進行識別，且與二代測序方法相比，CIRI-long對環(huán)形RNA的檢測效率有著近20倍的提升，對表達豐度較低的環(huán)形RNA有著更好的識別效果，同時可以識別到長度更長的環(huán)形RNA分子，大幅提升了環(huán)形RNA全長的檢測能力。

利用該方法，研究進一步發(fā)現(xiàn)了一類由內(nèi)含子自連形成的新型環(huán)形RNA分子（Intronic self-ligated circRNA）。這類環(huán)形RNA具有特殊的剪接位點內(nèi)側(cè)的GT-AG信號和較高的兩側(cè)序列保守性，在之前工作中缺乏普遍研究。此外，研究人員在小鼠不同組織中，對內(nèi)含子自連型環(huán)形RNA的表達模式開展了進一步探究，發(fā)現(xiàn)Tpm1基因可以產(chǎn)生一個長度為767bp的內(nèi)含子自連型環(huán)形RNA——circTpm1。與Tpm1基因的其他內(nèi)含子相比，該分子成環(huán)區(qū)域具有相對較高的保守性，且與線性mRNA在組織間具有不同的表達模式，說明circTpm1并非其母本基因轉(zhuǎn)錄的副產(chǎn)物，可能具有一定的生物學(xué)功能。

綜上，研究人員開發(fā)了基于納米孔測序技術(shù)的環(huán)形RNA全長識別流程CIRI-long，通過結(jié)合滾環(huán)反轉(zhuǎn)錄擴增和納米孔長讀長測序技術(shù)，可直接測定環(huán)形RNA的全長序列，實現(xiàn)了對環(huán)形RNA的高靈敏度檢測和內(nèi)部結(jié)構(gòu)重構(gòu)。與傳統(tǒng)的二代測序方法相比，CIRI-long大幅提升了環(huán)形RNA全長重構(gòu)能力，并可實現(xiàn)與二代測序相近的分析成本。同時，CIRI-long提供了樣本間整合分析的工具，并針對納米孔測序的高錯誤率建立了有效校正方法，為環(huán)形RNA的功能研究提供了重要的方法學(xué)工具，具有很高的應(yīng)用價值。

該研究工作由趙方慶團隊完成，獲得國家杰出青年科學(xué)基金、國家重點研發(fā)計劃及中科院的支持。趙方慶團隊在前期的工作中建立了環(huán)形RNA識別、可變剪接檢測及定量等方法，相關(guān)研究發(fā)表在Nature Biotechnology（2021）、Nature Communications（2016，2020）、Genome Biology（2015，2020）、Briefings in Bioinformatics（2018）、Trends in Genetics（2018）、Genome Medicine（2019）、Cell Reports（2019）和Bioinformatics（2020）上。這些研究成果豐富了我們對環(huán)形RNA的組成及結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，為深入了解這一類特殊的RNA分子提供了重要工具和數(shù)據(jù)支持。

論文鏈接

圖1.環(huán)形RNA全長重構(gòu)的實驗與計算流程

圖2.基于納米孔測序全面揭示環(huán)形RNA的多樣性

來源：中科院