Nature子刊丨銳博m6A-seq整體服務(wù)助力m6A修飾調(diào)控免疫機(jī)制的發(fā)現(xiàn)-肽度TIMEDOO
N6-甲基腺苷（m6A）修飾通過(guò)調(diào)節(jié)mRNA生物學(xué)在細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，那么m6A修飾如何通過(guò)影響免疫轉(zhuǎn)錄本的翻譯而參與先天免疫的呢？2019年4月23日，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所曹雪濤院士課題組在Nature Communications發(fā)表了題為Mettl3-mediated mRNA m6A methylation promotes dendritic cell activation的文章，首次揭示RNA甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3介導(dǎo)的mRNA m6A甲基化促進(jìn)樹(shù)突細(xì)胞（DC）功能活化，對(duì)于深入理解RNA表觀修飾調(diào)控免疫基因表達(dá)的機(jī)制，進(jìn)一步闡明m6A修飾在免疫應(yīng)答及炎癥反應(yīng)中的功能具有重要意義。
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? 研究背景??

m6A是哺乳動(dòng)物mRNA中最常見(jiàn)的轉(zhuǎn)錄后修飾。最近研究表明，m6A修飾通過(guò)介導(dǎo)RNA衰變調(diào)節(jié)多種生物途徑，例如干細(xì)胞分化、腫瘤發(fā)生和病毒復(fù)制。然而，m6A修飾在免疫調(diào)控中的作用尚不清楚。樹(shù)突細(xì)胞（DC）是連接先天性和適應(yīng)性免疫應(yīng)答的抗原呈遞細(xì)胞（APC）。雖然已經(jīng)深入研究了調(diào)控DC發(fā)育和功能的轉(zhuǎn)錄網(wǎng)絡(luò)，但表觀遺傳機(jī)制（特別是mRNA m6A修飾）在該過(guò)程中的作用還不清楚。因此，確定m6A甲基化在控制DC活化中的作用對(duì)于更好地理解免疫應(yīng)答是至關(guān)重要的，也將具有重要的臨床意義。

? 研究結(jié)果??

1、m6A修飾水平在DC成熟期間升高
研究人員利用DC成熟和分化模型，包括骨髓來(lái)源的imDC（未成熟DC）、LPS刺激的BMDC（maDC：成熟DC）和DCreg（調(diào)控DC），來(lái)研究m6A修飾在DC的成熟和功能中的表達(dá)模式和生物學(xué)作用。發(fā)現(xiàn)與imDC和DCreg相比，maDC中m6A修飾水平顯著升高。隨著m6A修飾水平的動(dòng)態(tài)變化，m6A甲基轉(zhuǎn)移酶Mettl3、Mettl14和Wtap在maDC中也升高。
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然后對(duì)imDC、maDC和DCreg樣本進(jìn)行meRIP-seq分析轉(zhuǎn)錄組水平的mRNA m6A修飾（meRIP-seq整體服務(wù)由銳博生物RiboBio提供），發(fā)現(xiàn)高置信度的m6A峰分別在imDC、maDC和DCreg的6004、7990和6624個(gè)基因轉(zhuǎn)錄本中富集，并且這些m6A峰具有共同的序列元件GGACU。在DC中，m6A在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和終止密碼子位點(diǎn)附近達(dá)到峰值。而隨著maDC中m6A水平的升高，m6A峰在更多的maDC轉(zhuǎn)錄本中富集，通過(guò)GO富集分析表明這些轉(zhuǎn)錄本在免疫系統(tǒng)和炎癥反應(yīng)中富集。
2、Mettl3以m6A催化活性依賴(lài)性方式促進(jìn)DC成熟
m6A修飾由RNA甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物催化，而Mettl3是主要的催化亞基。為了進(jìn)一步探討m6A在DC成熟和功能中的作用，研究人員在DC中特異性缺失Mettl3（Mettl3KO），發(fā)現(xiàn)m6A水平明顯下降，MHC class II (I-Ab)和共刺激分子CD86、CD80、CD40的表達(dá)也降低，并且在響應(yīng)LPS刺激中損害促炎細(xì)胞因子IL-6、TNF-α和IL-12p70的產(chǎn)生。而重新過(guò)表達(dá)Mettl3可恢復(fù)CD86、I-Ab、CD80和CD40的表達(dá)以及IL-6、TNF-α和IL-12p70的分泌。表明Mettl3依賴(lài)于其m6A催化活性促進(jìn)DC的成熟表型和促炎細(xì)胞因子分泌。
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3、Mettl3以m6A催化活性依賴(lài)性方式促進(jìn)T細(xì)胞活化中的DC功能
接下來(lái)，研究人員分析了Mettl3KO DC在體外和體內(nèi)促進(jìn)T細(xì)胞增殖的功能。發(fā)現(xiàn)Mettl3KO maDC可啟動(dòng)同種異體CD4+ T細(xì)胞增殖并且使IFN-γ產(chǎn)生的能力受損，通過(guò)體外過(guò)表達(dá)Mettl3可恢復(fù)該表型。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也得到同樣的結(jié)果。表明Mettl3在體外和體內(nèi)通過(guò)其m6A催化活性對(duì)于促進(jìn)T細(xì)胞增殖所需的DC功能是必需的。
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4、Mettl3在DC成熟過(guò)程中增強(qiáng)先天反應(yīng)和NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)
為了探索Mettl3通過(guò)m6A修飾促進(jìn)DC成熟和活化的分子機(jī)制，研究人員對(duì)Mettl3KO和野生型小鼠的maDC進(jìn)行RNA-seq及qPCR驗(yàn)證。發(fā)現(xiàn)Mettl3缺失導(dǎo)致TLR4/NF-κB通路下游效應(yīng)分子，以及細(xì)胞因子IL-6和IL-12b mRNA水平的下調(diào)，并且下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本富集在免疫應(yīng)答，尤其是對(duì)LPS的先天性炎癥反應(yīng)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Mettl3KO DC中所有下調(diào)基因的生命期沒(méi)有差異。表明Mettl3KO DC中IL-6和IL-12 mRNA水平的降低可能是由于轉(zhuǎn)錄活性的降低而不是由于mRNA降解的加速。
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隨后，研究人員檢測(cè)了NF-κB途徑信號(hào)分子的蛋白質(zhì)表達(dá)和磷酸化水平。發(fā)現(xiàn)在LPS刺激后，Mettl3KO DC顯著降低信號(hào)分子TAK1、IKKα、IKKβ、ERK、JNK和NF-κB亞基p65的磷酸化水平。值得注意的是，Tirap在LPS刺激的Mettl3KO DC中具有較低的蛋白質(zhì)水平，這表明Mettl3可能在DC成熟和活化期間通過(guò)Tirap促進(jìn)NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。
5、Mettl3促進(jìn)體內(nèi)Tirap、CD80和CD40 mRNA翻譯
Mettl3是否通過(guò)m6A依賴(lài)性機(jī)制調(diào)控Tirap、CD80和CD40的表達(dá)？研究發(fā)現(xiàn)Mettl3KO DC中的Tirap mRNA水平與Mettl3WT DC中的相似，CD40和CD80在Mettl3KO DC中的mRNA水平相似，但蛋白水平降低。這三種分子（Tirap，CD40和CD80）在maDC中均進(jìn)行m6A修飾，并且在Mettl3KO maDC中m6A修飾水平顯著降低。隨后的全基因組核糖體分析及qPCR驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，與Mettl3KO maDC相比，Tirap、CD80和CD40在Mettl3KO maDC中均具有較低的翻譯效率。進(jìn)一步的螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)得到類(lèi)似的結(jié)果。表明Mettl3介導(dǎo)的m6A修飾可促進(jìn)Tirap、CD80和CD40的表達(dá)翻譯。
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6、CD40和CD80的m6A依賴(lài)性翻譯增強(qiáng)與Ythdf1正相關(guān)
考慮到測(cè)序和核糖體分析數(shù)據(jù)，m6A reader蛋白Ythdf1是否與CD40和CD80翻譯增加有關(guān)？研究人員通過(guò)IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ythdf1與野生型CD40或CD80 mRNA的相關(guān)性分別高于其突變型，表明Ythdf1可以識(shí)別以上所分析m6A修飾的mRNAs。而敲降Ythdf1可降低Mettl3WT小鼠maDC中CD40和CD80的蛋白表達(dá)水平。表明Ythdf1在促進(jìn)CD40和CD80 mRNA翻譯中的作用。
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總之，本研究證明了Mettl3介導(dǎo)的CD40，CD80和Tirap的m6A在促進(jìn)DC活化和成熟中起重要作用：CD40和CD80的上調(diào)表達(dá)有助于增加DC的抗原呈遞和T細(xì)胞刺激，并且 Tirap的高表達(dá)有助于增強(qiáng)TLR4 / NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)和增加促炎細(xì)胞因子的分泌。
來(lái)源：銳博生物