2019年4月10日，清華大學結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心隋森芳教授研究組在《科學·進展》（Science Advances）期刊上在線發(fā)表題為《SNARE復(fù)合體解聚的機制研究》（Mechanistic insights into the SNARE complex disassembly）的研究論文，通過解析SNARE解聚分子機器20S復(fù)合體的高分辨率冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)，并結(jié)合生化實驗、電生理實驗和交聯(lián)質(zhì)譜實驗，揭示了SNARE復(fù)合體的解聚機制。

膜融合是生命基本和重要的過程之一，真核細胞多種形式的胞內(nèi)區(qū)間具有不同的生物化學性質(zhì)，細胞維持這些胞內(nèi)分區(qū)之間的動態(tài)平衡主要依賴的是囊泡轉(zhuǎn)運，該過程與許多重要疾病密切相關(guān)。囊泡轉(zhuǎn)運即包含轉(zhuǎn)運物質(zhì)的囊泡從供體出芽然后轉(zhuǎn)移至目標膜，錨定之后與目標膜融合，從而使得膜蛋白、磷脂和內(nèi)容物轉(zhuǎn)運至另一個細胞區(qū)間。神經(jīng)遞質(zhì)的釋放就是通過突觸囊泡與質(zhì)膜的融合實現(xiàn)的。

位于囊泡膜上的v-SNARE蛋白和位于目標膜上的t-SNARE蛋白在形成SNARE復(fù)合體的過程中將兩膜拉近并驅(qū)動膜融合的發(fā)生。SNARE復(fù)合體是非常穩(wěn)定的四螺旋束結(jié)構(gòu)，必須被解聚成單體以便循環(huán)使用，在細胞內(nèi)這是通過馬達蛋白NSF及其接頭蛋白SNAP共同完成的。NSF蛋白是一種多細胞功能相關(guān)的ATP酶（AAA+?ATPase），它與接頭蛋白SNAP、SNARE復(fù)合體一起形成沉降系數(shù)為20S的復(fù)合體。在20S復(fù)合體中，NSF在SNAP的幫助下利用水解ATP產(chǎn)生的能量將SNARE復(fù)合體解開成單體，使胞內(nèi)膜融合的過程得以循環(huán)進行。20S復(fù)合體是一個非常高效的分子機器，對其工作機制的研究不僅有助于深入理解胞內(nèi)SNARE的循環(huán)利用機制及膜融合的調(diào)控機制，也對揭示AAA+?ATPase酶的分子機理具有重要的意義，因此一直是科學家們研究的熱點問題。

隋森芳教授研究組長期致力于利用冷凍電鏡技術(shù)研究與生物膜相關(guān)的重要蛋白復(fù)合體的結(jié)構(gòu)與功能。此前，曾于2012年在《自然結(jié)構(gòu)與分子生物學》（Nature Structural & Molecular Biology）期刊上報道了全長NSF蛋白在水解ATP過程中各個狀態(tài)的三維結(jié)構(gòu)以及20S復(fù)合體的負染電鏡三維結(jié)構(gòu)。隨后，又于2015年在《細胞研究》（Cell Research）期刊上報道了20S復(fù)合體的低分辨率冷凍電鏡三維結(jié)構(gòu)和SNAP-SNARE亞組裝體中等分辨率的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)并驗證了新的解聚關(guān)鍵氨基酸。在此次發(fā)表的《科學·進展》論文中，研究人員通過優(yōu)化冷凍樣品制備條件將錨定在納米盤（Nanodisc，模擬細胞膜的脂質(zhì)雙分子層）上的20S復(fù)合體的分辨率推進至4.6??，并進一步通過分割重構(gòu)法將NSF六聚體和α-SNAP-SNARE亞組裝體的分辨率提高到3.9??和3.7??（圖1）。
科研成果 | 隋森芳課題組在Science Advances發(fā)文報道膜融合介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放關(guān)鍵蛋白SNARE復(fù)合體的解聚機制-肽度TIMEDOO
圖1 ?α-SNAP-SNARE亞組裝體電鏡結(jié)構(gòu)的分辨率分布和典型氨基酸殘基的密度
這些高分辨率結(jié)構(gòu)揭示了20S復(fù)合物中蛋白質(zhì)相互作用的許多細節(jié)。結(jié)合生化分析，研究者發(fā)現(xiàn)在SNARE解聚過程中，α-SNAPs主要通過R116殘基的靜電作用和L197殘基的疏水作用對VAMP單鏈的兩個位點施加作用力。為了進一步評價R116和L197在體內(nèi)的功能相關(guān)性，研究者與清華大學生命學院姚駿老師課題組合作檢測了這些突變體對培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)的影響。結(jié)果表明，與野生型α-SNAP過表達相比，R116A和L197A顯著降低了突觸小泡的釋放速度，表明這兩個突變體可能通過降低SNARE復(fù)合物的解聚能力而顯著削弱了膜融合（圖2）。
科研成果 | 隋森芳課題組在Science Advances發(fā)文報道膜融合介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放關(guān)鍵蛋白SNARE復(fù)合體的解聚機制-肽度TIMEDOO
圖2 ?電生理實驗檢測α-SNAP的R116殘基和L197殘基的功能
此外結(jié)合交聯(lián)質(zhì)譜實驗，研究者證明了SNARE螺旋束的氨基末端與NSF-D1結(jié)構(gòu)域的中心孔環(huán)之間有直接相互作用，并驗證了這種相互作用可能作為錨定支點在SNARE復(fù)合體的解聚中發(fā)揮重要作用。該研究提供了一個詳細的α-SNAP介導(dǎo)的SNARE復(fù)合體解聚的旋轉(zhuǎn)模型（圖3）：NSF利用ATP水解產(chǎn)生的能量帶動α-SNAP圓筒沿右手方向旋轉(zhuǎn)從而對SNARE復(fù)合體的左手方向螺旋束施加解旋方向的切線力——主要來自于α-SNAP蛋白的?R116殘基與VAMP蛋白的E62和D68殘基的靜電作用以及α-SNAP蛋白的L197殘基與VAMP蛋白的V48、V50和L54殘基的疏水作用。同時由于SNARE復(fù)合物的N端直接錨定在NSF-D1的孔區(qū)，右手扭矩將開始展開和/或破壞左手螺旋的SNARE復(fù)合物，從而同時或連續(xù)地將復(fù)合物分解成單個蛋白質(zhì)。
科研成果 | 隋森芳課題組在Science Advances發(fā)文報道膜融合介導(dǎo)的神經(jīng)遞質(zhì)釋放關(guān)鍵蛋白SNARE復(fù)合體的解聚機制-肽度TIMEDOO
圖3 ?SNARE復(fù)合體解聚的模型
清華大學結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心隋森芳教授為本文的通訊作者；生命科學學院已畢業(yè)博士生黃軒（現(xiàn)為首都醫(yī)科大學附屬北京朝陽醫(yī)院醫(yī)學研究中心研究實習員）、生命科學學院孫珊副研究員、生命科學學院已畢業(yè)博士生王霄婧、生命科學學院前助研樊鳳輝為本文的共同第一作者。生命科學學院博士后周強（現(xiàn)為西湖大學特聘研究員）參與了電鏡數(shù)據(jù)分析；生命科學學院姚駿課題組進行了電生理實驗；北京生命科學研究所董夢秋研究員課題組進行了交聯(lián)質(zhì)譜的工作。國家蛋白質(zhì)科學研究（北京）設(shè)施清華基地冷凍電鏡平臺和計算平臺，以及清華大學高性能計算平臺為數(shù)據(jù)收集和處理提供了支持。膜生物學國家重點實驗室、北京市結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心、科技部、國家自然科學基金等為本研究提供了經(jīng)費支持。

來源：結(jié)構(gòu)生物學高精尖創(chuàng)新中心

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https://advances.sciencemag.org/content/5/4/eaau8164