近日，中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)（中國(guó)科大）合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心集成影像中心、生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部無(wú)膜細(xì)胞器與細(xì)胞動(dòng)力學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院（深圳先進(jìn)院）腦信息中心畢國(guó)強(qiáng)/劉北明/陶長(zhǎng)路團(tuán)隊(duì)，聯(lián)合美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校周正洪（Z. Hong Zhou）團(tuán)隊(duì)、南方科技大學(xué)王培毅團(tuán)隊(duì)、以及深圳先進(jìn)院孫堅(jiān)原團(tuán)隊(duì)，通過(guò)自主研發(fā)的毫秒級(jí)時(shí)間分辨原位冷凍電鏡成像技術(shù)，破解了神經(jīng)信息傳遞過(guò)程中，突觸囊泡釋放與快速回收的生物物理過(guò)程——“親吻-收縮-逃逸/融合”（Kiss-Shrink-Run/Collapse）（圖1）。這一成果統(tǒng)一了半個(gè)世紀(jì)以來(lái)學(xué)界關(guān)于突觸囊泡釋放與回收機(jī)制的兩個(gè)爭(zhēng)議模型，為理解神經(jīng)信號(hào)傳遞、神經(jīng)可塑性及相關(guān)腦疾病機(jī)理提供全新視角。相關(guān)成果于北京時(shí)間10月17日發(fā)表在《科學(xué)》期刊。

圖1.時(shí)間分辨冷凍電鏡技術(shù)解析突觸囊泡釋放與回收動(dòng)態(tài)過(guò)程

大腦功能的實(shí)現(xiàn)，依賴于神經(jīng)元之間高效而精準(zhǔn)的突觸傳遞。當(dāng)動(dòng)作電位到達(dá)突觸前終端時(shí)，突觸囊泡釋放神經(jīng)遞質(zhì)實(shí)現(xiàn)信號(hào)的跨神經(jīng)元傳遞。20世紀(jì)50年代，伯納德·卡茨（Bernard Katz）提出突觸傳遞過(guò)程中神經(jīng)遞質(zhì)的量子化釋放假說(shuō)，奠定了神經(jīng)信息傳遞的細(xì)胞機(jī)制基礎(chǔ)。至1970年代初，學(xué)界逐漸形成兩種對(duì)立的突觸囊泡釋放模型：全融合（Full-collapse）和親吻-逃逸（Kiss-and-run）。然而，由于囊泡釋放過(guò)程發(fā)生在毫秒時(shí)間尺度、結(jié)構(gòu)變化處于納米空間尺度，技術(shù)手段的局限使得關(guān)于這兩種模型的爭(zhēng)議長(zhǎng)期懸而未決，成為困擾神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域半個(gè)世紀(jì)的難題。

冷凍電鏡斷層成像技術(shù)（cryo-electron tomography， cryo-ET），能夠?qū)焖倮鋬龊蠼頎顟B(tài)的細(xì)胞樣品直接進(jìn)行三維成像，已成為在細(xì)胞原位解析蛋白質(zhì)等生物大分子結(jié)構(gòu)及其三維空間分布的強(qiáng)有力工具。自2010年起，團(tuán)隊(duì)致力于將cryo-ET成像應(yīng)用于神經(jīng)突觸的結(jié)構(gòu)與功能研究，經(jīng)過(guò)多年攻關(guān)，成功實(shí)現(xiàn)對(duì)原代培養(yǎng)神經(jīng)細(xì)胞中完整突觸的cryo-ET成像。進(jìn)一步，得益于團(tuán)隊(duì)自主研發(fā)的三維重構(gòu)軟件IsoNet，研究人員清晰分辨出不同形態(tài)的突觸囊泡；并首次在突觸前區(qū)域，觀測(cè)到一類直徑約29納米的“小囊泡”（正常突觸囊泡直徑在42納米左右），推測(cè)其為囊泡釋放的中間狀態(tài)（圖2）。

圖2.冷凍電鏡原位成像實(shí)現(xiàn)對(duì)囊泡三維形態(tài)的分割與定量表征

為驗(yàn)證這一猜測(cè)，并進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)對(duì)突觸囊泡釋放動(dòng)態(tài)過(guò)程的精準(zhǔn)解析，研究人員將光遺傳學(xué)刺激與投入式冷凍技術(shù)進(jìn)行耦合，開(kāi)發(fā)出毫秒級(jí)時(shí)間分辨的冷凍電鏡制樣技術(shù)。具體實(shí)驗(yàn)中，在神經(jīng)元中表達(dá)光敏蛋白，利用光刺激精準(zhǔn)誘發(fā)動(dòng)作電位，隨后在不同時(shí)間間隔（4~300毫秒）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速冷凍固定，從而捕捉囊泡釋放的瞬時(shí)狀態(tài)?；诖朔椒?，團(tuán)隊(duì)獲取了上千套高分辨率的神經(jīng)突觸三維重構(gòu)數(shù)據(jù)。

隨后，研究人員利用cryo-ET子斷層三維平均技術(shù)（Sub-tomogram average），對(duì)不同狀態(tài)的囊泡進(jìn)行三維平均。在三維平均圖像中，可以清晰分辨出囊泡與細(xì)胞膜的半融合結(jié)構(gòu)、囊泡與細(xì)胞膜形成的狹小融合孔、以及介導(dǎo)囊泡融合的蛋白復(fù)合物，進(jìn)一步明確了這些囊泡是處于釋放的中間狀態(tài)。另一方面，研究人員通過(guò)對(duì)上千套突觸數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析，發(fā)現(xiàn)了不同形態(tài)囊泡的數(shù)量隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化（圖3）。

圖3.時(shí)間分辨冷凍電鏡技術(shù)捕捉突觸囊泡釋放的動(dòng)態(tài)過(guò)程

基于上述結(jié)果，研究團(tuán)隊(duì)繪制出突觸囊泡釋放與回收的完整過(guò)程，并提出全新理論模型：囊泡在動(dòng)作電位觸發(fā)后4 毫秒內(nèi)，先與突觸前膜融合形成~4納米的融合孔（“親吻”，kiss），隨后收縮成表面積為原來(lái)一半的小囊泡（“收縮”，shrink），最后，大部分小囊泡在70毫秒內(nèi)開(kāi)始以“逃逸”（Run）方式回收，少部分則與突觸前膜“全融合”（Collapse）（圖4）。

圖4.突觸囊泡釋放與快速回收

這一研究更新了傳統(tǒng)認(rèn)知：囊泡釋放并非簡(jiǎn)單的全融合或親吻-逃逸，而是包含一個(gè)關(guān)鍵的中間收縮階段。這一“親吻-收縮-逃逸”機(jī)制，不僅統(tǒng)一了爭(zhēng)議半個(gè)世紀(jì)的兩種模型，同時(shí)提示了神經(jīng)突觸高效與高保真?zhèn)鬟f的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，也為深入理解神經(jīng)信號(hào)傳遞、突觸可塑性以及相關(guān)腦疾病的機(jī)理提供了新視角。相關(guān)創(chuàng)新技術(shù)對(duì)研究細(xì)胞內(nèi)其他動(dòng)態(tài)過(guò)程也具有應(yīng)用價(jià)值。

中國(guó)科大特任副研究員陶長(zhǎng)路、博士生田崇禮（現(xiàn)為中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)院博士后）、博士生劉云濤（現(xiàn)為加州大學(xué)洛杉磯分校博士后）、博士生盧振航為該論文的共同第一作者。中國(guó)科大與深圳先進(jìn)院雙聘畢國(guó)強(qiáng)教授和劉北明教授、中國(guó)科大陶長(zhǎng)路特任副研究員、美國(guó)加州大學(xué)洛杉磯分校周正洪（Z. Hong Zhou）教授為本論文的共同通訊作者。南方科技大學(xué)王培毅（現(xiàn)山東農(nóng)業(yè)大學(xué)教授）團(tuán)隊(duì)、深圳先進(jìn)院孫堅(jiān)原團(tuán)隊(duì)為本研究提供了重要支持。中國(guó)科大合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心集成影像中心、南方科技大學(xué)冷凍電鏡中心、加州大學(xué)洛杉磯分校電子納米成像中心為本項(xiàng)目實(shí)驗(yàn)開(kāi)展提供了關(guān)鍵平臺(tái)支撐。本研究獲科技創(chuàng)新2030-“腦科學(xué)與類腦研究”重大項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項(xiàng)、廣東省和深圳市等科技項(xiàng)目資助。

論文鏈接：

https://www.science.org/doi/10.1126/science.ads7954

（合肥微尺度物質(zhì)科學(xué)國(guó)家研究中心、生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部、科研部、新聞中心）

來(lái)源：中國(guó)科大