北京大學生命科學學院杜鵬課題組發(fā)現(xiàn)由DGCR8/FLII/JUN介導的瞬時轉錄激活事件調控著床期胚胎的形態(tài)轉變
在早期胚胎發(fā)育過程中，胚胎著床是一個極為關鍵的生物學事件。其間胚胎植入母體子宮，建立母胎交流界面，這是后續(xù)發(fā)育的基礎。然而這一過程充滿風險，臨床上常常出現(xiàn)因著床失敗導致的生育問題。由于該過程極為瞬時和動態(tài)，胚胎著床方面的研究仍是一個“黑匣子”。
miRNA是真核生物中保守的轉錄后調控機制，并在著床過程中起到重要作用。DGCR8是miRNA合成通路的核心蛋白，它與DROSHA一起組成Microprocessor復合體，切割pri-miRNA上的莖環(huán)結構形成pre-miRNA，pre-miRNA再進一步被加工為成熟的miRNA。1 DCGR8敲除后，胚胎無法發(fā)育至著床后階段，暗示著DGCR8在著床過程中起到重要作用，然而該致死表型卻不能完全用miRNA的缺陷來解釋。2,3
與尚不清楚的著床期過程相比，人們對于著床前胚胎和著床后的胚胎已有廣泛的研究，這主要得益于體外干細胞模型的建立。由著床前胚胎分離得到的干細胞被稱為na?ve mESCs（小鼠胚胎干細胞），而著床后胚胎分離得到的干細胞被稱為Formative/Primed mESCs，這幾種細胞已被廣泛應用各種發(fā)育問題的研究。4,5?北京大學生命科學學院/北大-清華生命科學聯(lián)合中心/北京大學核糖核酸北京研究中心的杜鵬教授課題組在2018年捕捉到了一種介于naive和Formative/primed多能性的中間態(tài)多能性干細胞，稱為Poised mESCs。6,7 該狀態(tài)代表了處于著床期的胚胎，且由一組特異的miRNA所調控。
2024年7月1日，杜鵬課題組在Molecular cell雜志在線發(fā)表了題為“A transient transcriptional activation governs unpolarized-to-polarized morphogenesis during embryo implantation”的研究論文。在本研究中，研究者運用na?ve-poised-formative/Primed等干細胞模型，結合實驗室先前在miRNA調控方面的研究基礎，解釋了驅動著床期胚胎形狀建成的分子驅動力，主要內容概括如下：
1. DGCR8作為miRNA合成通路的核心蛋白，可以發(fā)揮不依賴于miRNA的轉錄抑制的非經典功能。在na?ve mESCs中（代表著床前胚胎），DGCR8可以結合位于mRNA上短的莖環(huán)結構，招募并隔離轉錄激活子FLII，抑制轉錄進行。在Poised mESCs中（代表著床中胚胎），ERK通路瞬時激活，使得FLII受到磷酸化修飾并與DGCR8解離，進而與轉錄因子JUN結合并激活細胞遷移基因的轉錄。著床后ERK通路迅速失活（Formative mESCs），DGCR8重新結合并抑制FLII。因此DGCR8/FLII/JUN在ERK通路的介導下，在著床期特異地介導了一個瞬時轉錄激活事件的發(fā)生（圖1）。
2. 該轉錄激活事件控制了胚胎著床期由無序狀態(tài)到極化狀態(tài)的形態(tài)轉變，且該事件在人和小鼠是保守的（圖1）。
圖1. 在著床前（naive）-著床中（Poised）-著床后（Formative）發(fā)育過程中，DGCR8/FLII/JUN在ERK通路調控下介導瞬時轉錄激活事件的發(fā)生，進而調控著床期胚胎形態(tài)轉變
本研究具體結論如下：
一、在na?ve mESCs中，DGCR8通過結合mRNA上的莖環(huán)結構，招募并抑制轉錄激活子FLII。
基于前期的na?ve小鼠胚胎干細胞中DGCR8互作蛋白數(shù)據(jù)/Co-IP/Pull down，作者發(fā)現(xiàn)，DGCR8與轉錄激活子FLII存在直接的蛋白相互作用。然而FLII并不參與miRNA合成通路。進一步的通過遺傳學手段，作者發(fā)現(xiàn)：DGCR8和FLII共同在轉錄水平上控制了一組不受miRNA調控的基因，該類基因主要參與細胞遷移等活動，稱為非miRNA靶向基因。DGCR8可以抑制，但FLII可以激活此類基因的轉錄。
為了進一步研究DGCR8如何抑制這類基因的轉錄，在na?ve小鼠胚胎干細胞中，作者通過eCLIP實驗鑒定了DGCR8/FLII的RNA結合靶點，同時在eCLIP實驗中還摻入了S4U，可以同時鑒定出新生的RNA（nascent RNA）。作者發(fā)現(xiàn)DGCR8和FLII同時結合了大量的靶基因的新生mRNA，且DGCR8結合區(qū)域傾向于形成莖環(huán)結構。該莖環(huán)結構顯著短于pri-miRNA上的莖環(huán)結構，并不能被DGCR8和DROSHA形成的復合體結合并切割。通過敲除DGCR8所結合的位于靶基因mRNA上的莖環(huán)結構，靶基因的轉錄抑制狀態(tài)被解除。這證明DGCR8確實通過結合mRNA上的莖環(huán)結構來抑制轉錄。
綜上，這說明DGCR8一方面和DROSHA結合負責pri-miRNA的切割，一方面結合在靶基因mRNA上的莖環(huán)結構，招募并抑制轉錄激活子FLII，從而抑制轉錄的進行（圖2）。
圖2. 在na?ve（代表著床前胚胎）小鼠胚胎干細胞中，DGCR8結合靶基因mRNA上的莖環(huán)結構，招募并隔離轉錄激活子FLII，抑制轉錄進行
二、FLII在Poised mESCs（代表著床期胚胎）中與DGCR8解離，并與轉錄因子JUN結合，激活基因轉錄。
通過na?ve-poised（著床前→著床中）轉變體系，作者發(fā)現(xiàn)：FLII在只有在Poised時期（著床中）才具有轉錄激活活性，而在na?ve時期（著床前）則沒有。與此對應的是FLII在Poised時期解除了與DGCR8的互作，同時也不再結合靶基因的mRNA。這說明FLII與DGCR8的解離是FLII具有轉錄激活活性的關鍵條件。通過一系列生化實驗，作者證明na?ve-poised轉變過程中，ERK通路瞬時激活，磷酸化FLII，使得FLII與DGCR8不再結合。同時磷酸化的FLII會與轉錄因子JUN互作增強（圖3）。進一步的通過JUN的CUT&Tag實驗發(fā)現(xiàn)，JUN可以廣泛結合在FLII激活的靶基因上，且JUN在Flii敲除中的細胞中無法結合靶基因。這說明JUN只有與FLII結合才能夠結合靶基因，激活其轉錄（圖3）。
圖3. 在Poised（代表著床中的胚胎）小鼠胚胎干細胞中，ERK激活誘導DGCR8與FLII的解離，促進FLII與JUN形成新的復合體激活基因轉錄
三、Poised mESCs代表小鼠和人的著床期胚胎，這一時期的胚胎正經歷無序到極化的形態(tài)轉變。
通過與體內胚胎的轉錄組比較，作者發(fā)現(xiàn)Poised ESCs的轉錄組與小鼠與人的著床期胚胎轉錄組最為相似（小鼠為E4.75天，人為E8天）。這一時期胚胎的上胚層細胞逐漸從無序狀態(tài)變成玫瑰花環(huán)樣的極化結構。且在體外培養(yǎng)的著床期小鼠胚胎中，能夠觀察到JUN和其他靜息態(tài)多能性標記基因的表達，進一步證明了已有結論。通過體外的模擬無序到極化的形態(tài)轉變體系，作者發(fā)現(xiàn)抑制該轉錄激活事件都會導致無序到極化結構形態(tài)轉變的失敗。因此，本文中鑒定到的轉錄激活事件對應于著床期胚胎，而激活基因以細胞遷移相關基因為主，則對應著這一時期細胞的形態(tài)轉變（圖4）。
綜上，該研究發(fā)現(xiàn)了DGCR8獨立于miRNA之外的轉錄抑制功能，并與FLII/JUN一起，在ERK通路的控制下，控制了著床期的瞬時轉錄激活事件，進而控制這一時期的形態(tài)建成。
圖4. Poised ESCs（靜息態(tài)多能性干細胞）代表著床期的小鼠/人胚胎，其epiblast正經歷無序到極化的形態(tài)轉變。本文鑒定的轉錄激活事件對應于這一形態(tài)轉變過程
杜鵬為該論文的通訊作者。北京大學生命科學學院博士后呂學暉、崔英姿，前沿交叉學科研究院博士后孔寅飛為本文的并列第一作者。北京大學博士畢業(yè)生楊敏、博士后申輝、博士后李詩雨、已出站博士后翁建莉，北京大學張哲研究員及其博士生廖述筠，中國科學院動物研究所王皓毅研究員及其博士畢業(yè)生安辰瑞，山東大學李艷研究員對本文有重要貢獻。該項工作得到了國家重點研發(fā)計劃，國家自然科學基金的支持。
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來源：北京大學
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