氨基酸作為構成蛋白質的基本單位，對蛋白質的結構和功能至關重要，而其變化也與多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。盡管目前利用堿基編輯等技術^1,2可以在基因組中實現(xiàn)堿基替換進而改變密碼子，產生內源氨基酸的突變，但在全蛋白質組范圍內對特定氨基酸殘基進行系統(tǒng)性的功能分析仍然面臨挑戰(zhàn)。

2023年11月22日，北京大學生命科學學院魏文勝教授團隊在Molecular Cell雜志在線發(fā)表了題為“Unbiased interrogation offunctional lysine residues in human proteome”的研究論文。該研究采用腺嘌呤堿基編輯工具，建立了一種在全蛋白質組范圍內篩選功能性氨基酸位點的策略，并通過細胞適應性篩選，獲得了蛋白質組功能性賴氨酸位點的圖譜。

在人類蛋白質組眾多的氨基酸殘基中，研究者首先關注了賴氨酸。賴氨酸殘基攜帶正電荷，在蛋白質的結構、與其他分子的相互作用等方面發(fā)揮著重要作用，同時也是多種蛋白質翻譯后修飾（如泛素化、乙?；⒓谆┑闹匾荏w氨基酸殘基。賴氨酸的密碼子為5’-AAA或5’-AAG，利用腺嘌呤編輯器（Adenine base editors, ABEs）對其密碼子進行編輯，可以實現(xiàn)賴氨酸的定向突變（圖1）。

圖1. 賴氨酸定向突變示意圖

該研究利用ABEmax系統(tǒng)在人視網膜色素上皮細胞系RPE1中構建了靶向賴氨酸位點的sgRNA文庫³，包含約30萬條sgRNA，覆蓋了85%的編碼基因、85%的蛋白質以及35%的賴氨酸密碼子。為提高篩選質量并大幅縮減建庫所需細胞數(shù)量，研究者結合團隊前期建立的iBAR策略進行了細胞適應性篩選⁴，最終獲得了1572個促進或抑制細胞存活的賴氨酸突變位點。

基于課題組前期在RPE1細胞系中進行的基因敲除篩選結果⁵，研究者將賴氨酸位點的得分映射到其所在基因上，形成了基因（蛋白）-賴氨酸位點的功能性圖譜（圖2）。值得注意的是，大量賴氨酸位點的突變導致細胞表現(xiàn)出與相應基因敲除不同的細胞適應性表型。在這些突變位點中，有805個位點突變后會抑制細胞存活，然而對應的基因敲除卻未對細胞存活產生影響或促進細胞存活。通過對國際癌癥基因組聯(lián)盟數(shù)據(jù)庫（ICGC）的數(shù)據(jù)挖掘，研究者鑒定了若干具有臨床意義的賴氨酸突變位點，包括已有報道的TP53-K120、BRAF-K601、PTEN-K13等位點，然而大多數(shù)賴氨酸位點的功能仍不為人知。

圖2. 兩種篩選結果對比圖

在正向富集的賴氨酸位點中，研究者發(fā)現(xiàn)了一個以CUL3為核心的調控網絡。CUL3是泛素化復合物（cullin-RING ligases，CRLs）中的重要成員。該研究篩選到位于其骨架蛋白、接頭蛋白、激活蛋白、底物蛋白多個賴氨酸位點（圖3）。通過親和純化-質譜等方法，研究者發(fā)現(xiàn)CUL3-K638E能夠顯著削弱CUL3和去nedd化復合物（COP9 signalosome，CSN）的結合，導致其持續(xù)處于nedd化狀態(tài)而最終降低了穩(wěn)定性。

圖3. CUL3 CRLs復合物

最終，研究者將關注點聚焦在CUL3的接頭蛋白KCTD10的K171位點上，該位點在一名乳腺癌患者體內檢測到了突變（K171E）。通過一系列實驗，研究者證實KCTD10-K171能夠發(fā)生乙?；揎棧⑼ㄟ^調控細胞周期蛋白TPX2和INCENP的蛋白穩(wěn)態(tài)來控制下游信號通路，確保細胞周期正常進行。KCTD10-K171的突變可能導致細胞周期蛋白無法正常降解，從而引起細胞過度增殖。該位點可能成為潛在的癌癥標志突變，有助于癌癥的診斷和預后，并為新藥研發(fā)提供指導。

總的來說，本研究利用堿基編輯技術成功建立了高通量的氨基酸精度功能性篩選方法，為系統(tǒng)性研究蛋白質功能和調控機制提供了新的有效手段。同時，所得到的氨基酸精度的蛋白質功能性大數(shù)據(jù)為更深入地理解蛋白質調控機制，尤其是翻譯后修飾機制，提供了有力的依據(jù)（圖4）。

圖4. 總結圖

魏文勝課題組博士后寶穎、博士研究生潘倩和已畢業(yè)的許萍博士和劉志恒博士為論文的共同第一作者，魏文勝和副研究員周卓（現(xiàn)為中國醫(yī)學科學院系統(tǒng)醫(yī)學研究院/蘇州系統(tǒng)醫(yī)學研究所研究員）為論文的共同通訊作者。該研究獲得了國家重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金、北京市科委生物醫(yī)學前沿創(chuàng)新推進項目、中國醫(yī)學科學院醫(yī)學與健康科技創(chuàng)新工程、北大-清華生命科學聯(lián)合中心、北京昌平實驗室、重大疾病共性機制研究全國重點實驗室等的支持。

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來源：北京大學