浙大聯(lián)合良渚實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)癌癥免疫治療新靶點(diǎn)，通過(guò)下調(diào) PD-L1 激發(fā)自體免疫，成果將通過(guò)公司進(jìn)行轉(zhuǎn)化
腫瘤是“機(jī)體內(nèi)某一局部組織細(xì)胞的過(guò)度增生”，很多人都知道它可以分為良性腫瘤和惡性腫瘤。
但腫瘤其實(shí)也分冷熱，學(xué)界將有免疫原性、會(huì)被自身免疫細(xì)胞攻擊的腫瘤稱為 “熱腫瘤”，而無(wú)免疫原性、容易逃避免疫系統(tǒng)攻擊的稱為 “冷腫瘤”。
其中，“冷腫瘤”在接受免疫治療后往往療效不佳，一直是醫(yī)生與患者頭痛的難題。
目前，腫瘤靶向治療已成為腫瘤研究中的熱點(diǎn)，通過(guò)對(duì)腫瘤特異性靶點(diǎn)的選擇性攻擊，可以在較少損害正常組織的情況下，針對(duì)性地對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行攻擊。
近年來(lái)，對(duì)于某些特定的腫瘤如 EGFR表達(dá)陽(yáng)性的肺癌、Her2 表達(dá)陽(yáng)性的乳腺癌，靶向治療方法的效果比較出色。
然而，有一些癌癥組織在受體表達(dá)上與正常組織相比并沒(méi)有明顯不同，甚至可以通過(guò)高表達(dá)正常組織具有的免疫信號(hào)分子來(lái)逃避免疫系統(tǒng)的攻擊，比如三陰性乳腺癌。
許多能逃避免疫系統(tǒng)攻擊的腫瘤細(xì)胞表面，都具有 PD-1（程序性死亡受體1）蛋白的配體 PD-L1 蛋白，該蛋白也存在于抗原提呈細(xì)胞表面；而 PD-1 蛋白則位于活化的 T 細(xì)胞表面。PD-L1蛋白通過(guò)結(jié)合PD-1蛋白抑制 T 細(xì)胞的炎癥活動(dòng)，削弱免疫系統(tǒng)對(duì)外來(lái)侵略的攻擊，并促進(jìn)自身耐受。這避免了自身免疫性疾病的產(chǎn)生，但也導(dǎo)致了癌細(xì)胞的免疫逃逸。
打個(gè)比方，腫瘤細(xì)胞與 T 細(xì)胞好比在打諜戰(zhàn)，而 PD-1 與 PD-L1 是暗號(hào)，如果腫瘤細(xì)胞能在 T 細(xì)胞喊出 “PD-1”時(shí)對(duì)上暗號(hào) “PD-L1” 來(lái)證明身份，T 細(xì)胞就不會(huì)攻擊。
基于腫瘤細(xì)胞的這種特性，針對(duì) PD-1 和 PD-L1 的單克隆抗體，已廣泛應(yīng)用于臨床的抗腫瘤治療。
但對(duì)于不同類(lèi)型的腫瘤，單抗藥物的臨床反應(yīng)率不僅不一致、而且普遍較低，甚至已有文獻(xiàn)認(rèn)為目前的 PD-1 抗體治療，對(duì)于三陰性乳腺癌是無(wú)效的。此外，昂貴的價(jià)格，也給腫瘤患者們帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
為克服 PD-1/PD-L1 抗體藥物的一系列不足之處，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院 / 良渚實(shí)驗(yàn)室的夏宏光團(tuán)隊(duì)在最新研究中，篩選了一系列調(diào)控PD-L1蛋白水平下降的先導(dǎo)化合物，并闡明了 PD-L1 蛋白新的降解機(jī)制。
他們發(fā)現(xiàn)，ARIH1（Ariadne RBR E3 Ubiquitin Protein Ligase 1），是負(fù)責(zé)靶降解 PD-L1 的 E3 泛素連接酶。
他們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞會(huì)通過(guò) EGFR-GSK3α-ARIH1 信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)逃避免疫系統(tǒng)攻擊的機(jī)制，并提示 ARIH1 是腫瘤免疫治療新的潛在藥物靶點(diǎn)。
4 月 20 日，相關(guān)論文以標(biāo)題 ARIH1 signaling promotes anti-tumor immunity by targeting PD-L1 for proteasomal degradation 發(fā)表于 Nature Communications。
圖 | 相關(guān)論文（來(lái)源：受訪者）
高通量篩選確定促進(jìn) PD-L1 降解的先導(dǎo)化合物
該團(tuán)隊(duì)對(duì) 2125 種 FDA 批準(zhǔn)的藥物及候選藥物進(jìn)行高通量篩選之后，鑒定了 一系列促進(jìn)PD-L1 降解的先導(dǎo)化合物。
為了建立一個(gè)基于熒光的測(cè)定內(nèi)源性 PD-L1 膜蛋白水平的高通量篩選模型，夏宏光使用了與藻紅蛋白（P-phycoerythrin,PE）結(jié)合的 PD-L1 抗體和干擾素 -γ（IFNγ）處理的 U937 細(xì)胞（組織細(xì)胞性淋巴肉瘤細(xì)胞系）。
其中，干擾素 -γ 增強(qiáng)了 PD-L1 的基礎(chǔ)表達(dá)水平，使得后者的動(dòng)態(tài)范圍更廣，因而其結(jié)果也更具精確性與說(shuō)服力。
該團(tuán)隊(duì)還發(fā)現(xiàn)，在這些 FDA 批準(zhǔn)的藥物及候選藥物中，共有 160 種藥物可以降低 PD-L1 膜蛋白水平。
隨后，夏宏光根據(jù)這些先導(dǎo)化合物參與的信號(hào)通路，對(duì)陽(yáng)性藥物進(jìn)行分類(lèi)，其中包括 JAK/STAT 通路（The Janus kinase/signal transducer and activator of tran-ions）抑制劑、磷脂酰肌醇 3 – 激酶（PI3K）/蛋白激酶 B/mTOR 通路抑制劑、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)激酶抑制劑等，這些都是已知的能對(duì)PD-L1膜蛋白水平發(fā)揮調(diào)控功能的通路抑制劑。
圖 | 篩選可有效降低PD-L1膜蛋白水平的先導(dǎo)化合物（來(lái)源：受訪者）
鎖定研究對(duì)象 ——靶向藥物 ES-072
已有大量研究表明，表皮生長(zhǎng)因子受體信號(hào)通路可激發(fā) PD-L1 表達(dá)，并引起腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸。篩選獲得的靶向藥物 ES-072 也是表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑，是夏宏光參與開(kāi)發(fā)的靶向新藥，夏宏光將它定為研究對(duì)象。
為探索靶向藥物 ES-072 誘導(dǎo) PD-L1 降解的背后機(jī)制，該團(tuán)隊(duì)測(cè)試了ES-072 處理后PD-L1是否會(huì)發(fā)生磷酸化變化，并通過(guò)生物質(zhì)譜等實(shí)驗(yàn)證實(shí)了 PD-L1 的降解取決于其胞內(nèi)段 Ser279 和 Ser283 這兩個(gè)位點(diǎn)的磷酸化。
由于表皮生長(zhǎng)因子受體活性喪失會(huì)導(dǎo)致蛋白激酶 B 活性下降，而蛋白激酶 B可同時(shí)調(diào)控糖原合成激酶 – GSK3α 與 GSK3β。
為搞清楚到底誰(shuí)起了主要作用，他們進(jìn)行了大量實(shí)驗(yàn)，并利用生物質(zhì)譜等技術(shù)發(fā)現(xiàn)了一系列與 PD-L1 相互作用的激酶蛋白。
其中，ES-072 處理后，GSK3α 與 PD-L1 膜蛋白的相互作用，顯著增強(qiáng)（見(jiàn)下圖）。
圖 | PD-L1 免疫沉淀后的質(zhì)譜分析結(jié)果（來(lái)源：受訪者）
體外磷酸化等并行實(shí)驗(yàn)也證明，表皮生長(zhǎng)因子受體抑制劑誘導(dǎo)的 PD-L1 Ser279/283 位點(diǎn)磷酸化是由 GSK3α介導(dǎo)的。
E3 泛素連接酶登上舞臺(tái)
在理清楚這條通路后，夏宏光又提出了新問(wèn)題 —— 在使用靶向藥物 ES-072 治療后，究竟是哪個(gè) E3 泛素連接酶促進(jìn)了 PD-L1 的泛素化和降解呢？
在分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)后，他發(fā)現(xiàn)除了已知的介導(dǎo) PD-L1 降解的 Cullin 連接酶外，靶向藥物 ES-072 還促進(jìn)了 PD-L1 與名為 ARIH1 的 E3 泛素鏈接酶的相互作用。同時(shí)他還發(fā)現(xiàn)，ARIH1 的瞬時(shí)過(guò)表達(dá)，可促進(jìn) PD-L1 的 K48 相關(guān)泛素化增強(qiáng)。
此外，ARIH1 在人肺腺癌細(xì)胞H1975和人胚胎腎細(xì)胞 293 中高表達(dá)，可“劑量依賴”地促進(jìn)內(nèi)源性 PD-L1 降解，而 ARIH1 敲除則導(dǎo)致內(nèi)源性 PD-L1 水平增加。一系列實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ARIH1 能直接泛素化 PD-L1，并介導(dǎo)其通過(guò)蛋白酶體降解。
接下來(lái)，夏宏光測(cè)試了 GSK3α介導(dǎo)的 PD-L1 在 Ser279/283 位點(diǎn)的磷酸化是否促進(jìn)了 PD-L1 招募 ARIH1。
他和團(tuán)隊(duì)將穩(wěn)定表達(dá) ARIH1的人胚胎腎細(xì)胞 293，轉(zhuǎn)染上野生型 PD-L1 或耐磷酸化的 S279A、S283A、2SA（S279A 和 S283A 兩個(gè)位點(diǎn)的合稱）突變體。
結(jié)果顯示，在 S279A 和 S283A 突變的細(xì)胞中，ARIH1 高表達(dá)誘導(dǎo)的 PD-L1 泛素化大量減少，與此一致的是，ARIH1 與 PD-L1 的相互作用也因 2SA 突變而顯著降低。
靶向藥物 ES-072 的處理，增強(qiáng)了 ARIH1 和野生型 PD-L1 之間的相互作用，但沒(méi)有增強(qiáng)其和 PD-L1 2SA 突變體的相互作用，而 GSK3α 高表達(dá)誘導(dǎo)的 PD-L1 泛素化，則被 ARIH1 的敲除所阻斷。
因此，該團(tuán)隊(duì)得出結(jié)論，GSK3α 驅(qū)動(dòng)PD-L1的 Ser279/283 磷酸化，PD-L1隨后招募 ARIH1 并通過(guò) K48 相關(guān)泛素鏈將自身泛素化，并靶向蛋白酶體降解。
圖 | GSK3α 介導(dǎo)的 PD-L1 的磷酸化促進(jìn) PD-L1/ARIH1 相互作用和 ARIH1 誘導(dǎo)的降解 活體實(shí)驗(yàn)效果喜人
在活體實(shí)驗(yàn)方面，該團(tuán)隊(duì)分別使用 4T1 小鼠乳腺癌細(xì)胞、免疫缺陷裸鼠、和野生型正常小鼠，來(lái)評(píng)估 ARIH1 在調(diào)控 PD-L1 降解和腫瘤發(fā)生中的作用。
據(jù)悉，當(dāng)4T1細(xì)胞注射到 BALB/c 小鼠（白變種實(shí)驗(yàn)室老鼠，即俗稱的 “小白鼠 “）中時(shí)，小白鼠體內(nèi)可自發(fā)產(chǎn)生高轉(zhuǎn)移性腫瘤，并在注射部位形成原發(fā)灶。實(shí)驗(yàn)表明，4T1細(xì)胞在小白鼠中的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移特性與人體中的三陰性乳腺癌非常相似。
在4T1細(xì)胞中高表達(dá) ARIH1，對(duì)4T1細(xì)胞的體外增殖、以及在免疫缺陷裸鼠的生長(zhǎng)并沒(méi)有影響。但是，在免疫功能正常的小白鼠中，ARIH1高表達(dá)腫瘤生長(zhǎng)受到了極大的抑制，其中大部分小白鼠的腫瘤完全消退。
（來(lái)源：受訪者）
同時(shí)，在 ARIH1 高表達(dá)腫瘤微環(huán)境中，浸潤(rùn)腫瘤的免疫細(xì)胞、活化 CD8 + 細(xì)胞、毒性 T 細(xì)胞的水平明顯增加。并且，ARIH1 高表達(dá)還導(dǎo)致炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)增加，包括干擾素 -γ、腫瘤壞死因子 -α 、炎性趨化因子 CCL-5 、以及 T 淋巴細(xì)胞趨化因子 CXCL-10等。
（來(lái)源：受訪者）
4T1 系小鼠乳腺癌細(xì)胞，是逃離免疫系統(tǒng)攻擊的癌細(xì)胞中的佼佼者，ARIH1 能使免疫系統(tǒng)發(fā)生活躍的炎性反應(yīng)，這說(shuō)明 ARIH1 在促進(jìn)腫瘤免疫方面發(fā)揮了明顯作用，誘導(dǎo)ARIH1高表達(dá)的藥物在腫瘤免疫療中的應(yīng)用前景，非常值得期待。
那么在人體中，腫瘤細(xì)胞也是通過(guò)該機(jī)制來(lái)逃避免疫系統(tǒng)攻擊的嗎？
對(duì)腫瘤和其遠(yuǎn)端組織樣本的免疫組化分析顯示， ARIH1 蛋白水平在遠(yuǎn)端組織中的水平遠(yuǎn)高于腫瘤組織。
這一發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞與小鼠實(shí)驗(yàn)中 ARIH1 促進(jìn) PD-L1 降解的現(xiàn)象是一致的，這說(shuō)明人體腫瘤細(xì)胞中 ARIH1 表達(dá)的缺失，是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞PD-L1 蛋白累積的機(jī)制之一。
但導(dǎo)致腫瘤中 ARIH1 表達(dá)水平下降的機(jī)制還有待闡明。
圖 | 經(jīng) EGFR-GSK3α-ARIH1 調(diào)控的 PD-L1 膜蛋白降解示意圖
治愈疑難腫瘤未來(lái)可期，“冷腫瘤” 變 “熱腫瘤”
考慮到4T1細(xì)胞是一種著名的冷腫瘤，PD-1/PD-L1抗體單獨(dú)使用幾乎對(duì)4T1腫瘤沒(méi)有抑制作用，本研究結(jié)果還提示，ARIH1不僅可以調(diào)控PD-L1降解，而且可以重塑腫瘤微環(huán)境，可能是將“冷腫瘤”變成“熱腫瘤”的關(guān)鍵分子。夏宏光課題組通過(guò)后續(xù)的研究已經(jīng)初步探明ARIH1調(diào)控腫瘤“冷”、“熱”切換的機(jī)制，并開(kāi)始篩選誘導(dǎo)ARIH1高表達(dá)的先導(dǎo)化合物。
臨床上三陰性乳腺癌也是著名的 “冷腫瘤”，PD-1抗體在該適應(yīng)癥上的臨床實(shí)驗(yàn)已經(jīng)失??；本研究成果提示，誘導(dǎo)ARIH1表達(dá)的藥物小分子有望成為治療包括三陰性乳腺癌在內(nèi)的一系列“冷腫瘤”的靶向新藥。也就是說(shuō)，在未來(lái)的某一天，治愈三陰性乳腺癌、難治性黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等 “冷腫瘤”將不再是幻想！
2021 年初，夏宏光已成立公司，他表示本次成果也將在該公司進(jìn)行轉(zhuǎn)化。夏宏光博士也是良渚實(shí)驗(yàn)室研究員，負(fù)責(zé)“分子篩選與合成平臺(tái)”與個(gè)性化藥物篩選。
良渚實(shí)驗(yàn)室是浙江省實(shí)驗(yàn)室之一，成立于 2020 年 7 月，定位是“浙江省醫(yī)學(xué)科技策源地，生命健康產(chǎn)業(yè)主引擎”。良渚是杭州的一處地名，也是“中華文明的曙光 —— 良渚文化的發(fā)祥地”，以“良渚”命名該實(shí)驗(yàn)室，足見(jiàn)用意之深遠(yuǎn)。
圖 | 良渚實(shí)驗(yàn)室（來(lái)源：http://dwz.date/eXjw）
夏宏光從事“選擇性自噬” 研究逾十五年，師從美國(guó)科學(xué)院院士袁鈞瑛教授和中國(guó)科學(xué)院院士馬大為教授。他和馬大為院士合作開(kāi)發(fā)的第三代 EGFR（自噬上游調(diào)控蛋白）有機(jī)小分子抑制劑 ES-072，已獲美國(guó)臨床批和中國(guó) 1.1 類(lèi)新藥臨床批件，且已初步完成臨床 I 期實(shí)驗(yàn)。
談及未來(lái)，他說(shuō)，“希望所在團(tuán)隊(duì)成為全球選擇性自噬藥物開(kāi)發(fā)的領(lǐng)跑者?！?/p>
來(lái)源：麻省理工科技評(píng)論
