新型基因編輯系統(tǒng)引導(dǎo)編輯（prime editing，PE）可以在基因組的靶向位點(diǎn)實(shí)現(xiàn)任意類(lèi)型的堿基替換、小片段的精準(zhǔn)插入與刪除，這種靈活的、可設(shè)計(jì)的遺傳修飾能力使其在基礎(chǔ)研究、人類(lèi)疾病治療和農(nóng)作物育種中潛力巨大。該系統(tǒng)由nCas9（H840A）融合逆轉(zhuǎn)錄酶（reverse transcriptase，RT）和pegRNA（prime editing guide RNA）組成，在pegRNA的引導(dǎo)下，nCas9切割非靶標(biāo)鏈產(chǎn)生缺刻，釋放出可與其PBS序列結(jié)合的游離單鏈，從而起始逆轉(zhuǎn)錄酶對(duì)RT模板的逆轉(zhuǎn)錄過(guò)程，然后通過(guò)DNA修復(fù)將RT模板上對(duì)應(yīng)的堿基改變引入基因組。脫靶效應(yīng)是基因組編輯技術(shù)應(yīng)用轉(zhuǎn)化時(shí)需要解決的重要科學(xué)問(wèn)題，然而引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在體內(nèi)是否存在全基因組范圍的脫靶尚未知，亟待全面、系統(tǒng)的評(píng)估。近日，中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所研究員高彩霞研究組在植物細(xì)胞及個(gè)體兩個(gè)水平上對(duì)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)進(jìn)行了深入和系統(tǒng)的評(píng)估。

針對(duì)引導(dǎo)編輯pegRNA依賴(lài)型的脫靶效應(yīng)，研究設(shè)計(jì)了一系列在pegRNA的間隔序列（Spacer）與引物結(jié)合位點(diǎn)(PBS)序列不同位置上分別引入數(shù)量不同的錯(cuò)配堿基，發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)對(duì)間隔序列近PAM端或PBS的5’端的錯(cuò)配的容忍程度較低。研究進(jìn)一步對(duì)179個(gè)潛在的內(nèi)源脫靶位點(diǎn)的引導(dǎo)編輯情況進(jìn)行高深度的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在水稻內(nèi)源位點(diǎn)鮮有脫靶編輯。因此，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的pegRNA依賴(lài)型的脫靶效應(yīng)非常低，可通過(guò)pegRNA合理設(shè)計(jì)提升該系統(tǒng)的特異性。

高彩霞研究組前期研究表明，胞嘧啶堿基編輯器BE3可能造成不依賴(lài)于向?qū)NA全基因組水平的脫靶效應(yīng)（Jin et al.，Science，2019）。同時(shí)，由于水稻基因組小且再生植株具有相似的遺傳背景，可以克服動(dòng)物全基因組重測(cè)序過(guò)程中大量的異質(zhì)細(xì)胞序列分析的復(fù)雜性難題。因此，研究重點(diǎn)評(píng)估了引導(dǎo)編輯系統(tǒng)是否造成不依賴(lài)pegRNA的全基因組范圍的脫靶效應(yīng)。通過(guò)對(duì)引導(dǎo)編輯水稻植株的全基因組測(cè)序分析，統(tǒng)計(jì)了全基因組范圍內(nèi)的堿基替換（single nucleotide variants，SNVs）和小片段插入與刪除突變（small insertions/deletions，Indels）數(shù)目，發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的表達(dá)不會(huì)在基因組內(nèi)引發(fā)額外的SNVs或Indels突變。研究還分析了外源過(guò)表達(dá)含有M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)是否會(huì)干擾細(xì)胞內(nèi)源的逆轉(zhuǎn)錄生物學(xué)過(guò)程。對(duì)水稻逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子OsTos17和端粒區(qū)域的拷貝數(shù)及保真性分析顯示，引導(dǎo)編輯不影響逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座活性以及端粒酶的活性。此外，對(duì)高豐度mRNA及pegRNA序列的逆轉(zhuǎn)錄-插入的可能性也進(jìn)行了分析，同樣發(fā)現(xiàn)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)沒(méi)有在全基因組范圍內(nèi)產(chǎn)生pegRNA或mRNA序列的隨機(jī)插入。以上結(jié)果表明，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)不會(huì)造成全基因組范圍的不依賴(lài)于pegRNA的脫靶效應(yīng)。

綜上所述，引導(dǎo)編輯系統(tǒng)在全基因組范圍具有很高的編輯特異性。4月15日，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在Nature Biotechnology（DOI:10.1038/s41587-021-00891-x）上。高彩霞研究組博士研究生靳帥、林秋鵬、朱子旭以，以及中科院微生物研究所博士駱迎峰為論文的共同第一作者，高彩霞為論文通訊作者。研究工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金委員會(huì)、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專(zhuān)項(xiàng)（A類(lèi)）、中科院前沿科學(xué)重點(diǎn)研究計(jì)劃與中科院青年創(chuàng)新促進(jìn)會(huì)的資助。

　　在植物細(xì)胞與個(gè)體兩個(gè)水平上對(duì)引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的特異性進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)。a、水稻原生質(zhì)體水平分析179個(gè)脫靶位點(diǎn)處引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的pegRNA依賴(lài)型脫靶突變；b、植物個(gè)體水平全基因組測(cè)序分析引導(dǎo)編輯系統(tǒng)pegRNA不依賴(lài)型脫靶突變的實(shí)驗(yàn)流程與設(shè)計(jì)；c、d，control、PE和BE3處理組在基因組內(nèi)的SNVs（c）與indels（d）數(shù)目。e、f，各處理組中含有端粒reads分布及數(shù)目比較；g、比較control與PE處理組中Cas9與HPT編碼區(qū)的reads所占T-DNA區(qū)域總reads的比例。

來(lái)源：中科院