國(guó)際首次：李華偉/舒易來(lái)團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPR基因編輯，預(yù)防獲得性感音神經(jīng)性聾-肽度TIMEDOO全球超過(guò)13億人患有后天性聽(tīng)力下降，感音神經(jīng)性聾（sensorineural hearing loss，SNHL）最多見(jiàn)，致聾原因主要包括噪音、耳毒性藥物、衰老、遺傳、感染等因素，目前尚無(wú)可治療的藥物（突發(fā)性耳聾除外）。氨基糖甙類(lèi)抗生素（aminoglycosides，AGs）所致耳毒性聾是獲得性SNHL的主要類(lèi)型之一。
對(duì)于需要多療程靜脈用藥的患者（例如，結(jié)核病和囊性纖維化病患者），AGs耳毒性的致病率甚至超過(guò)50%，但臨床上缺乏有效的防治對(duì)策。Htra2基因編碼的線粒體絲氨酸蛋白酶Omi/HtrA2，可與X連鎖凋亡抑制蛋白（XIAP）結(jié)合發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。李華偉/舒易來(lái)團(tuán)隊(duì)在前期研究中發(fā)現(xiàn)Htra2基因在新霉素?fù)p傷后的耳蝸中表達(dá)水平明顯上升，可能參與了耳毒性聾的發(fā)病。CRISPR/Cas9基因編輯已在遺傳性聾基因治療研究領(lǐng)域取得了一定進(jìn)展，但尚無(wú)用于防治獲得性非遺傳性SNHL的研究。2021年3月22日，復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院李華偉教授與舒易來(lái)研究員團(tuán)隊(duì)在Genome Biology?期刊上發(fā)表了題為：Prevention of acquired sensorineural hearing loss in mice by in vivo Htra2 gene editing 的研究論文。
該研究設(shè)計(jì)了兩種針對(duì)Htra2基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)（SpCas9和SaCas9系統(tǒng)），通過(guò)新型腺相關(guān)病毒（AAV）Anc80L65運(yùn)載進(jìn)入小鼠內(nèi)耳，實(shí)現(xiàn)在體Htra2基因有效編輯，促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞存活，顯著改善氨基糖甙類(lèi)抗生素暴露后小鼠的聽(tīng)覺(jué)功能。
據(jù)悉，這是國(guó)際上首個(gè)基于CRISPR/Cas9基因編輯用于防治獲得性非遺傳性感音神經(jīng)性聾成功的研究。
國(guó)際首次：李華偉/舒易來(lái)團(tuán)隊(duì)通過(guò)CRISPR基因編輯，預(yù)防獲得性感音神經(jīng)性聾-肽度TIMEDOO
該研究首先構(gòu)建針對(duì)Htra2基因的SpCas9系統(tǒng)，設(shè)計(jì)了三個(gè)特異性的向?qū)NA（guide RNAs，gRNAs），在體外HEI-OC1細(xì)胞系檢測(cè)三個(gè)gRNAs的切割活性，發(fā)現(xiàn)Sp-g1、Sp-g2和Sp-g3的體外編輯效率分別為87.27 ± 0.02%、71.72 ± 1.27%和74.88 ± 0.77%。之后在體外培養(yǎng)的耳蝸Corti氏器中驗(yàn)證Anc80L65–SpCas9體系對(duì)耳蝸毛細(xì)胞的保護(hù)作用。
AAV-Anc80L65可高效轉(zhuǎn)導(dǎo)耳蝸內(nèi)、外毛細(xì)胞，但AAV包裝容量有限，很難通過(guò)單載體包裝整個(gè)SpCas9系統(tǒng)。該研究采用split-SpCas9策略，將SpCas9分割，并用雙AAV包裝；通過(guò)多位點(diǎn)切割提高敲除效率。在體外Corti氏器新霉素?fù)p傷模型中，所構(gòu)建的Anc80L65–SpCas9–Htra2-gRNA治療體系可敲除Htra2基因，促進(jìn)耳蝸毛細(xì)胞存活，有效預(yù)防了氨基糖甙類(lèi)抗生素的耳毒性。
在體外新霉素?fù)p傷模型中證實(shí)了該基因編輯系統(tǒng)的有效性后，進(jìn)一步于體內(nèi)探索該系統(tǒng)的療效。由于Anc80L65–SpCas9系統(tǒng)需要分割成雙AAV，這可能會(huì)影響整個(gè)Cas9系統(tǒng)在毛細(xì)胞的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率。因此，該研究也構(gòu)建了Anc80L65–SaCas9單AAV載體系統(tǒng)，檢測(cè)其對(duì)新霉素耳毒性聾的預(yù)防作用。
研究發(fā)現(xiàn)，在體內(nèi)新霉素?fù)p傷模型中，無(wú)論是SpCas9還是SaCas9系統(tǒng)，均能有效預(yù)防氨基糖甙類(lèi)抗生素所致耳毒性聾。經(jīng)過(guò)AAV–SpCas9體系預(yù)處理的小鼠在新霉素?fù)p傷后2周表現(xiàn)出更多的毛細(xì)胞存活，尤其在耳蝸中、底圈區(qū)域。該基因治療體系對(duì)小鼠聽(tīng)覺(jué)功能也有明顯保護(hù)作用。聽(tīng)力改善最明顯的小鼠在8 kHz的ABR閾值比對(duì)側(cè)耳下降40 dB。實(shí)驗(yàn)觀察到新霉素?fù)p傷后8周，AAV–SpCas9體系的聽(tīng)力保護(hù)作用仍然長(zhǎng)期持續(xù)。
AAV–SaCas9體系同樣可以促進(jìn)耳蝸中、底圈毛細(xì)胞的存活并改善聽(tīng)力。4周齡小鼠注射耳的ABR閾值在測(cè)試的所有頻率（4、8、16、24和32 kHz）均比未注射耳顯著下降，平均保護(hù)閾值10–20 dB。在小鼠6周齡，保護(hù)效果仍十分明顯，最好的閾值改善達(dá)到50 dB。課題組同時(shí)進(jìn)行了AAV–CRISPR/SpCas9及SaCas9體系的安全性評(píng)估，在研究觀察期內(nèi)，未發(fā)現(xiàn)明顯的脫靶情況，且對(duì)野生型小鼠的聽(tīng)力沒(méi)有影響，說(shuō)明該治療體系是安全的。
該研究證明了Htra2基因是潛在的預(yù)防氨基糖甙類(lèi)抗生素耳毒性的治療靶點(diǎn)；還證明了以基因編輯體系對(duì)Htra2編輯可安全、有效預(yù)防氨基糖甙類(lèi)抗生素所致耳毒性聾，為獲得性聾的干預(yù)臨床轉(zhuǎn)化提供了科學(xué)依據(jù)。
復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院李華偉教授和舒易來(lái)研究員為共同通訊作者，顧晰博士后、王大奇博士后和徐值嬌助理實(shí)驗(yàn)師為共同第一作者。該研究的第一單位和通訊單位均為復(fù)旦大學(xué)附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院。
來(lái)源：生物世界