對(duì)復(fù)雜的細(xì)胞代謝進(jìn)行重編程需要對(duì)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行表達(dá)調(diào)控。目前常用的基因表達(dá)調(diào)控方法是在離位（ex-situ）構(gòu)建啟動(dòng)子或核糖體結(jié)合位點(diǎn)（RBS）的質(zhì)粒文庫(kù)，轉(zhuǎn)化進(jìn)入細(xì)胞進(jìn)行篩選，然而該方法受限于克隆效率和轉(zhuǎn)化效率，難以實(shí)現(xiàn)多基因同時(shí)的表達(dá)調(diào)控。MAGE技術(shù)可在染色體原位（in-situ）產(chǎn)生遺傳多樣性，從而同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)基因的表達(dá)。但是，該技術(shù)仍依賴(lài)于單鏈DNA文庫(kù)的高效轉(zhuǎn)化和與染色體的高效重組，可應(yīng)用的宿主較為有限。

中國(guó)科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所研究員王猛帶領(lǐng)的高通量編輯與篩選平臺(tái)實(shí)驗(yàn)室，與研究員鄭平帶領(lǐng)的系統(tǒng)與合成生物技術(shù)研究團(tuán)隊(duì)合作，利用CRISPR引導(dǎo)的堿基編輯技術(shù)開(kāi)發(fā)出不需要外源DNA模板、不依賴(lài)重組即可在染色體原位產(chǎn)生遺傳多樣性的多基因表達(dá)調(diào)控技術(shù)，并命名為BETTER（Base Editor-Targeted and Template-free Expression Regulation）。BETTER的工作原理是在需要調(diào)控的目的基因前插入特定的啟動(dòng)子、RBS、5’UTR等表達(dá)調(diào)控元件，然后使用CRISPR引導(dǎo)的堿基編輯器對(duì)表達(dá)調(diào)控元件進(jìn)行編輯，產(chǎn)生遺傳多樣性，原位構(gòu)建表達(dá)調(diào)控元件文庫(kù)，從而調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)水平。該過(guò)程不需要合成和轉(zhuǎn)化DNA文庫(kù)，不依賴(lài)于外源DNA與染色體的同源重組，且不產(chǎn)生雙鏈DNA斷裂，因此具有高效、簡(jiǎn)便、宿主普適性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。該技術(shù)在重要的工業(yè)與模式菌株谷氨酸棒桿菌和枯草芽孢桿菌中均已應(yīng)用，最多實(shí)現(xiàn)了十個(gè)基因的同時(shí)表達(dá)調(diào)控，并篩選獲得高效利用木糖、甘油和高效合成番茄紅素的菌株。BETTER技術(shù)為復(fù)雜代謝途徑中多基因的表達(dá)調(diào)控提供了新思路。堿基編輯技術(shù)在PAM識(shí)別、底物譜、產(chǎn)物譜、編輯窗口等性能的不斷優(yōu)化，以及在越來(lái)越多宿主中的應(yīng)用，為BETTER技術(shù)的優(yōu)化升級(jí)和推廣應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

研究工作得到國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃、天津市合成生物技術(shù)創(chuàng)新能力提升行動(dòng)、天津市“項(xiàng)目+團(tuán)隊(duì)”重點(diǎn)培養(yǎng)專(zhuān)項(xiàng)等的支持。相關(guān)研究成果發(fā)表在Nature Communications上。天津工生所副研究員王鈺、助理研究員程海嬌和劉揚(yáng)為論文共同第一作者，王鈺、鄭平和王猛為論文共同通訊作者。

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BETTER技術(shù)示意圖

來(lái)源：中科院