DNA和蛋白質(zhì)是生物中兩個最重要的生物大分子，它們之間的相互作用在細(xì)胞的生命活動中起著至關(guān)重要的作用。那么，它們之間相互作用是如何進(jìn)行的呢？相互作用所涉及的結(jié)合或者切割所需的特定靶向位點（Motif）會是什么序列？研究人員又是通過哪些技術(shù)來探測的？由于基因組中98%的序列是非蛋白編碼區(qū)，高通量大規(guī)模地來尋找所有可能的蛋白靶向位點是技術(shù)發(fā)展的必然趨勢。

2020年7月31日，國際著名期刊Science Advances雜志在線發(fā)表了深圳華大生命科學(xué)研究院的題為“DNB-based on-chip motif finding (DocMF): A high-throughput method to profile different types of protein-DNA interactions”（DocMF: 一種基于DNA納米球技術(shù)的在芯片上高通量鑒定不同蛋白-DNA互作位點的平臺）的研究論文。

△Science Advances網(wǎng)站截圖

這是一個以DNA納米球（DNBSEQ^TM）技術(shù)為基礎(chǔ)的，使用高通量測序芯片來分析蛋白質(zhì)-DNA相互作用的高靈敏度、高通量的鑒定平臺（簡稱DocMF）。使用該系統(tǒng)，研究團隊成功地鑒定了常用核酸內(nèi)切酶的識別位點（restriction sites），以及CRISPR/Cas蛋白特異性識別所需的PAM序列。

目前研究蛋白質(zhì)與DNA相互作用的靶向序列的方法有很多，常用的有微陣列技術(shù)（PBM：Protein-Binding Microarray）或者SELEX，但是這些方法通常費時費力且通量不夠高。與這些技術(shù)相比，DocMF除了能檢測出更多的蛋白和DNA結(jié)合位點，還能在DNA分子被蛋白切割后，大規(guī)模地提供有關(guān)與蛋白質(zhì)相互作用的Motif信息。因此，DocMF是目前第一個能夠同時鑒定蛋白切割位點以及蛋白與DNA靶向結(jié)合位點的高通量平臺。

DocMF利用華大智造獨有的DNBSEQ^TM測序技術(shù)和兩次成像拍照結(jié)合的方法來檢測蛋白質(zhì)-DNA相互作用中所涉及的切割或者結(jié)合所需的特異性靶向序列。從單個DNB的序列信息和熒光信號變化，我們可以找到與蛋白質(zhì)發(fā)生相互作用的所有序列，并通過生物信息學(xué)分析確定特定的靶向序列。測序芯片的通量可以允許一次性篩選十億級別、帶著不同序列的DNA納米球，大大高于PBM或者SELEX的通量，DocMF能夠很靈敏地找到弱結(jié)合力的所有互作位點序列。

△DocMF流程示意圖

運用DocMF方法，研究人員首先鑒定了不同類型的限制性內(nèi)切核酸酶以及CRISPR/Cas的識別位點。最新基因編輯工具CRISPR/Cas系統(tǒng)是存在于多數(shù)細(xì)菌和古菌中的一種后天免疫系統(tǒng)，經(jīng)生物學(xué)家改造后，可高效、便捷地實現(xiàn)基因定點修飾。此類Cas系統(tǒng)包含三個核心元件-Cas核酸酶，引導(dǎo)RNA（gRNA），間隔序列前體臨近基序（protospacer adjacent motif，PAM）。PAM序列對Cas蛋白特異性識別靶序列至關(guān)重要,也是CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)揮功效的關(guān)鍵特性之一。目前，現(xiàn)有的技術(shù)（E.coli雙抗實驗，Cas核酸酶切后高通量測序等），對PAM序列的鑒定仍存在不同的缺陷，如耗時長、靈敏度低等。利用DocMF，研究人員發(fā)現(xiàn)SpCas9除了經(jīng)典的5’-NGG-3’的PAM外，還有兩個較為少見的5’-NAG-3’和5’-NGA-3’的PAM序列，并且算出NAG出現(xiàn)幾率在5%左右，而更弱結(jié)合力的NGA只有1.6%。

文章還探索了兩個未發(fā)表的新型CRSIPR/Cas蛋白，VeCas9和BvCas12a。其中VeCas9的PAM序列用傳統(tǒng)的E.coli雙抗實驗方法無法準(zhǔn)確鑒定出。利用DocMF，這兩個新型CRISPR/Cas蛋白的寬松PAM序列也均能被準(zhǔn)確檢出。同時研究人員還能根據(jù)芯片上信號變化比值，對不同PAM序列的活性排序，找出結(jié)合力最強的PAM序列，有助于設(shè)計體內(nèi)基因編輯的最佳靶向位點。同時文章作者也討論說明DocMF還可以被用來尋找Cas蛋白的脫靶序列。因此，DocMF為新型基因編輯系統(tǒng)的研究提供了一個強有力的工具，將會更快地推進(jìn)更多新型編輯系統(tǒng)的發(fā)現(xiàn)及其功能研究。

△經(jīng)DocMF鑒定出的VeCas9和BvCpf1的PAM序列

為研究蛋白與DNA結(jié)合靶向位點的鑒定，團隊選用無切割活性的dCas9進(jìn)行測試，篩選出NGG序列為dCas9的PAM特異性位點，該特異性NGG序列是與以前的報道一致的。同時研究人員也發(fā)現(xiàn)，由于蛋白上兩個氨基酸的突變，導(dǎo)致dCas9無法像傳統(tǒng)的Cas9一樣對NAG和NGA序列進(jìn)行靶向結(jié)合。

△DocMF平臺鑒定的dCas9結(jié)合位點

綜上，DocMF平臺基于華大智造測序儀，提供了一種檢測多種蛋白質(zhì)-DNA互作靶向位點的高通量的方法。整個鑒定流程耗時約三天，包括文庫的制備、測序及分析，極大的縮減了工作時間及工作量。由于其高深度和高通量，也極大地提高了檢測的準(zhǔn)確性。

文章通訊作者之一、華大研究院院長徐訊表示，DocMF不只是全球唯一的能兼容鑒定蛋白與DNA結(jié)合或切割靶向位點的高通量平臺，也具有鑒定CRISPR系統(tǒng)脫靶位點、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點的潛力。DocMF平臺的開發(fā)，為后續(xù)蛋白質(zhì)-DNA互作的研究提供了一個強有力的工具，同時此研究也擴展了以DNA納米球為基礎(chǔ)的測序技術(shù)的應(yīng)用范圍，體現(xiàn)了國產(chǎn)化基因測序平臺研究工具的優(yōu)勢。