未來技術(shù)學(xué)院汪陽明實驗室最近鑒定了多個來源于微生物中的雙鏈DNA脫氨酶，并將其中一種改造成為線粒體堿基編輯器（圖1）。2023年2月16日，該項成果¹以“DddA homolog search and engineering expand mitochondrial base editing”為題在《自然-通訊》（Nature Communications）在線發(fā)表。

圖1. 思邈菌DddA衍生的線粒體堿基編輯器成功編輯多個線粒體基因組位點

細胞中的生物學(xué)反應(yīng)在種類繁多的細胞器中發(fā)生，其中線粒體十分特別，它是細胞的能量工廠，為細胞乃至人體活動提供能量，并且在多個層面參與細胞信號通路調(diào)控細胞的生死存亡和命運。更有意思的是，線粒體擁有自己的DNA。細胞中已知只有兩種細胞器擁有自己的DNA，另一種是葉綠體。目前已發(fā)現(xiàn)有上百種線粒體DNA的突變能夠?qū)е氯祟惣膊?，包括耳聾、心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病。如何糾正這些DNA突變來治療人類疾病，以及如何誘導(dǎo)特定的突變來模擬人類疾病和研究線粒體基因的功能，始終是領(lǐng)域內(nèi)的難題。對于細胞核中的DNA，科學(xué)家們可以通過CRISPR系統(tǒng)結(jié)合DNA脫氨酶實現(xiàn)特定堿基的高效突變。然而該系統(tǒng)由于外源RNA難以高效轉(zhuǎn)運至線粒體內(nèi)部（有爭議），在線粒體編輯中尚無實際應(yīng)用。這一問題的解決得益于一類新的DNA脫氨酶的發(fā)現(xiàn)。與CRISPR系統(tǒng)聯(lián)用的堿基編輯酶都是單鏈DNA脫氨酶，2020年前后，Mougous實驗室在伯克霍爾德菌中發(fā)現(xiàn)了一種脫氨酶，可以在雙鏈DNA上工作，因此命名為雙鏈DNA脫氨酶（Double strand DNA deaminase，DddA）。雙鏈脫氨酶是細菌對抗不同種屬細菌的一項利器，通過一種類似于注射器的裝置，伯克霍爾德菌將雙鏈脫氨酶注射進入其他細菌胞體內(nèi)，造成基因組的廣泛突變，從而殺死其他細菌。與David Liu實驗室合作，他們將DddA與另一類基因編輯常用的蛋白TALE相結(jié)合，成功實現(xiàn)了線粒體DNA的堿基突變²。然而，這類堿基編輯器的序列兼容性較低，例如最初的堿基編輯器DdCBE只對T之后的C有較高的編輯效率，編輯后將C突變?yōu)閁，該堿基將被識別為T。為了解決序列兼容性低的問題，領(lǐng)域內(nèi)常用的方法有兩種，一種是工程化改造原有編輯器，另一種是尋找其他種類的堿基編輯器。David Liu等人通過實驗室進化的方法得到了可以編輯A、T和C之后的C的堿基編輯器³，但能夠編輯G之后C的線粒體堿基編輯器仍然缺乏。

汪陽明實驗室的博士生米黎在研究伯克霍爾德菌DddA的序列和結(jié)構(gòu)時，發(fā)現(xiàn)其羧基端存在一段序列，這些序列對DddA的脫氨活性十分重要（圖2a）。利用這一重要信息，結(jié)合PSI-BLAST生物信息學(xué)分析手段，研究者在現(xiàn)有微生物的基因組序列中鑒定了多個與DddA同源的雙鏈脫氨酶。進一步的細致分析發(fā)現(xiàn)，來源于思邈菌（Simiaoa Sunni，以中國唐代“藥王”孫思邈命名）的DddA同源基因（Ddd_Ss），具有能夠編輯A、T和G之后C的活性（圖2b），從而有可能彌補目前線粒體堿基編輯器的缺口。作者進一步出示，利用Ddd_Ss構(gòu)造的線粒體堿基編輯器，成功在多種細胞中實現(xiàn)了對14個線粒體基因組特定位點的編輯。通過引入David Liu等人之前發(fā)現(xiàn)的提高脫氨酶活性的突變，作者成功構(gòu)建了模擬Leber遺傳性視神經(jīng)病變中的線粒體基因突變，發(fā)現(xiàn)這些突變會導(dǎo)致線粒體功能的減弱（圖2c、d）。有意思的是，反過來將Ddd_Ss中一個位點（N1370）引入到伯克霍爾德菌的DddA（Ddd_Bc）時，成功提高了Ddd_Bc衍生的線粒體堿基編輯器的活性和序列兼容性。這些研究拓展了線粒體堿基編輯器的序列兼容性，并為未來開發(fā)新的線粒體堿基編輯器提供資源和參考。

圖2. DddA羧基端序列的重要性（a）；三種不同來源的DddA的序列偏好(b)；以及經(jīng)Ddd_Ss衍生的線粒體堿基編輯器編輯后的細胞線粒體功能分析（c、d）

該研究拓展了線粒體堿基編輯器的序列兼容性，但并沒有解決該領(lǐng)域目前廣泛存在的脫靶問題，未來需要更多更精巧的設(shè)計來實現(xiàn)高效和高特異性的編輯。在那之前，線粒體堿基編輯器的應(yīng)用仍然會面臨挑戰(zhàn)。

米黎和北大-清華生命科學(xué)聯(lián)合中心博士生石銘為該論文共同第一作者。該研究得到了北京大學(xué)伊成器、高寧、魏文勝、程和平、王顯花和陳良怡實驗室的指導(dǎo)與幫助；研究由國家自然科學(xué)基金委和國家重點研發(fā)計劃“干細胞研究與器官修復(fù)”專項資助，新發(fā)現(xiàn)的雙鏈脫氨酶相關(guān)應(yīng)用申請專利一項。

1. Mi, L. et al. DddA homolog search and engineering expand sequence compatibility of mitochondrial base editing. Nature Communications14 (2023). https://doi.org:10.1038/s41467-023-36600-2

2. Mok, B. Y. et al. A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing. Nature 583, 631-637 (2020). https://doi.org:10.1038/s41586-020-2477-4

3. Mok, B. Y. et al. CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA. Nat Biotechnol (2022). https://doi.org:10.1038/s41587-022-01256-8

來源：北京大學(xué)