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高血壓影響著全球1/3的成年人,同時也是心血管疾病、腎臟疾病、癡呆的主要危險因素,在全球范圍內帶來巨大的健康和經濟負擔【1】。腎臟通過調節(jié)體液和電解質的穩(wěn)態(tài)來控制血壓,這歸功于遠曲小管上鈉氯協同轉運體NCC(sodium–chloride cotransporter),其可以回收Na+和Cl,進而調節(jié)酸堿平衡并控制血壓【2】。NCC轉運活性下降會引起吉特曼氏綜合癥 (Gitelman syndrome), 其特征為伴有低鉀血癥和代謝性堿中毒的低血壓【3】;而NCC轉運活性上升會引起假性醛固酮減少癥,其特征為伴有高鉀血癥和代謝性酸中毒的高血壓【4】。NCC是很多腎臟及心血管疾病的首要藥物治療靶點,包括像噻嗪類利尿劑,其作為第一個具有良好療效和安全性的口服降壓藥,仍然是目前首選的一線降壓藥【5】。盡管應用已久,但是噻嗪類利尿劑選擇性抑制NCC的機制目前仍然未知。
Nature | 噻嗪類利尿劑如何抑制遠曲小管回收Na+和Cl- —— 鈉氯協同轉運體NCC的結構解析-肽度TIMEDOO
2023年2月5日,來自美國斯坦福大學的馮亮課題組在Nature上發(fā)表了題為Structure and thiazide inhibition mechanism of the human Na–Cl cotransporter的文章。通過解析人源鈉氯協同轉運體(NCC)處于兩種不同構象及結合噻嗪類利尿劑的結構,提出了NCC轉運離子底物及噻嗪類利尿劑抑制轉運的分子機制。
作者通過生化實驗設計了兩個可以高表達的NCC克隆,隨后通過冷凍電鏡解析了3.0 ? 分辨率的向內開口構象的結構,和2.8 ? 分辨率結合降壓藥聚噻嗪的向外開口構象的結構。在兩個結構中,NCC都呈現為二聚體(圖1a和圖1b),每一個NCC亞基都由跨膜結構域(TMD)和胞質側調節(jié)結構域組成(NTD和CTD)(圖1c)。TMD中的TM1-TM12為APC折疊(圖1d)。在胞外側,一個cap結構域立在由TM1、TM2、TM6和TM7形成的螺旋束上(圖1d)。二聚體中的CTD相互交叉并形成穩(wěn)定二聚體的相互作用界面(圖1b)。
Nature | 噻嗪類利尿劑如何抑制遠曲小管回收Na+和Cl- —— 鈉氯協同轉運體NCC的結構解析-肽度TIMEDOO
圖1 人源NCC的整體結構
作者還在CTD處發(fā)現了ATP(或ADP)的密度(圖2a),將其相互作用的R655和L717突變則會造成轉運活性的下降(圖2d),說明了腺苷酸的結合對于NCC的功能起到了重要的作用。同時還在CTD的表面觀察到了與NTD的相互作用界面(圖2b),將其作用界面上的氨基酸做突變,可以觀察到NCC的轉運活性都存在著不同程度的下降(圖2e),提示著NTD-CTD的相互作用對于NCC功能至關重要。NTD中T139的磷酸化對于NCC激活起到了調控作用,在結構中可以發(fā)現其位于NTD-CTD交界面中由CTD組成的帶正電的區(qū)域(圖2c),提示其磷酸化可能會調節(jié)NTD-CTD的相互作用并介導CTD引起的構象變化。
Nature | 噻嗪類利尿劑如何抑制遠曲小管回收Na+和Cl- —— 鈉氯協同轉運體NCC的結構解析-肽度TIMEDOO
圖2 NCC的調節(jié)結構域
作者分析結合聚噻嗪的NCC結構,發(fā)現其呈現向外開口的構象,聚噻嗪結合在由TM1、TM3、TM6、TM8和TM10組成的口袋處,并與周圍的多個氨基酸相互作用,將其中的N149、F223、N227突變則會使得聚噻嗪抑制效果減弱,這與觀察到的結構相吻合(圖3)。
Nature | 噻嗪類利尿劑如何抑制遠曲小管回收Na+和Cl- —— 鈉氯協同轉運體NCC的結構解析-肽度TIMEDOO
圖3 聚噻嗪結合區(qū)域
在向外開口結合聚噻嗪的NCC結構中,NCC的門腔中途穿過Na+結合位點并在底部到達Cl結合位點,所以細胞外側溶液中的離子都可以到達這兩個位點(圖4a),而在靠近細胞內側的區(qū)域則被堵?。▓D4b);在向內開口的NCC結構中,這部分則是開放的(圖4c),兩個離子都可以從相應的結合位點處到達細胞內側。向內開口和向外開口的結構比對揭示了各種螺旋的移動機制(圖4d),比較聚噻嗪周圍的氨基酸,可以發(fā)現結合聚噻嗪的NCC如果由向外開口轉向向內開口狀態(tài),聚噻嗪會和TM10的I532和F536產生位阻(圖4e),揭示了聚噻嗪可以阻止NCC從向外開口轉變?yōu)橄騼乳_口狀態(tài)。另外,聚噻嗪結合區(qū)域與Cl結合位點重疊,所以聚噻嗪也可以直接阻止Cl結合。綜上,聚噻嗪通過與底物離子競爭結合并阻止構象轉變從而抑制NCC的功能。
Nature | 噻嗪類利尿劑如何抑制遠曲小管回收Na+和Cl- —— 鈉氯協同轉運體NCC的結構解析-肽度TIMEDOO
圖4 NCC的構象變化及聚噻嗪抑制NCC的機制
綜上,本文通過解析NCC處于向內開口及結合聚噻嗪向外開口的結構,解釋了噻嗪類利尿劑作用于腎臟遠曲小管上鈉氯協同轉運蛋白NCC靶點的機制,并為優(yōu)化噻嗪類藥物提供了結構生物學的指導意義。同時,NCC結構中其他調節(jié)轉運的結構域也為下一代藥物設計提供了基礎。
原文鏈接
https://doi.org/10.1038/s41586-023-05718-0
參考文獻
參考文獻
【1】Zhou, B., Perel, P., Mensah, G. A. & Ezzati, M. Global epidemiology, health burden and effective interventions for elevated blood pressure and hypertension. Nat. Rev. Cardiol. 18, 785–802 (2021).【2】Moes, A. D., van der Lubbe, N., Zietse, R., Loffing, J. & Hoorn, E. J. The sodium chloride cotransporter SLC12A3: new roles in sodium, potassium, and blood pressure regulation. Pflugers Arch. 466, 107–118 (2014).

【3】Simon, D. B. et al. Gitelman’s variant of Bartter’s syndrome, inherited hypokalaemic alkalosis, is caused by mutations in the thiazide-sensitive Na–Cl cotransporter. Nat. Genet. 12, 24–30 (1996).

【4】Lalioti, M. D. et al. Wnk4 controls blood pressure and potassium homeostasis via regulation of mass and activity of the distal convoluted tubule. Nat. Genet. 38, 1124–1132 (2006).

【5】Freis, E. D., Wanko, A., Wilson, I. M. & Parrish, A. E. Treatment of essential hypertension with chlorothiazide (diuril); its use alone and combined with other antihypertensive agents. J. Am. Med. Assoc. 166, 137–140 (1958).

來源:北京生物結構前沿研究中心