? ? ? ? ? ?基于CRISPR系統(tǒng)開發(fā)出的引導(dǎo)編輯系統(tǒng)（Prime Editing，PE）能夠在基因組的靶位點處實現(xiàn)精準的片段插入、刪除以及堿基的任意替換，在基因治療、育種改良、基礎(chǔ)研究等方面頗具應(yīng)用前景。中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所高彩霞研究組前期在水稻、小麥中建立并優(yōu)化了植物引導(dǎo)編輯系統(tǒng)，實現(xiàn)了任意堿基精準的替換、增添或刪除。然而，在應(yīng)用過程中，研究組發(fā)現(xiàn)該系統(tǒng)存在效率偏低、設(shè)計復(fù)雜等問題，難以滿足育種需要以及在不同基礎(chǔ)研究場景下的需求（Lin et al., Nature Biotechnology, 2020）。對此，研究組通過對PE系統(tǒng)進行多輪升級改造，開發(fā)出“Tm值指導(dǎo)PBS序列設(shè)計”“雙pegRNA策略”“逆轉(zhuǎn)錄酶的工程化改造”三種優(yōu)化策略，將引導(dǎo)編輯系統(tǒng)效率平均提升了10倍以上，并開發(fā)了在線的高效、自動化引導(dǎo)編輯實驗設(shè)計網(wǎng)站PlantPegDesigner（Lin et al., Nature Biotechnology, 2021；Zong et al., Nature Biotechnology, 2022）。

　　為了進一步推進引導(dǎo)編輯的應(yīng)用，高彩霞研究組在Nature Protocols上發(fā)表論文，闡釋了如何克服引導(dǎo)編輯設(shè)計復(fù)雜的問題。該工作描述了高效pegRNA的設(shè)計方法：前期研究發(fā)現(xiàn)植物細胞中pegRNA的編輯效率與PBS序列的Tm值（melting temperature，Tm）有關(guān)，在水稻中PBS序列Tm值為30℃的pegRNA能夠獲得最大的編輯效率；使用雙pegRNA策略，即針對所需突變同時向細胞中遞送分別靶向DNA兩條鏈的兩個pegRNA進行共同編輯，可進一步大幅提升植物引導(dǎo)編輯的編輯效率。科研人員論述了在線自動化pegRNA設(shè)計網(wǎng)站PlantPegDesigner的使用流程。該網(wǎng)站可兼顧上述兩種策略，提供完整的pegRNA選擇、設(shè)計與推薦方案，方便使用者快速設(shè)計高活性pegRNA。進一步，該研究闡明如何使用能夠穩(wěn)定提高編輯效率的ePPE引導(dǎo)編輯器。相比于傳統(tǒng)版本的引導(dǎo)編輯器，ePPE在堿基替換、小片段插入、刪除以及較大片段的插入和刪除等多種編輯類型下的編輯效率顯著提升，且不增加副產(chǎn)物及脫靶效應(yīng)。該論文闡述了載體組合的使用、基于原生質(zhì)體的編輯效率檢測、引導(dǎo)編輯系統(tǒng)的植物細胞熒光報告系統(tǒng)的使用以及引導(dǎo)編輯實驗結(jié)果的二代測序數(shù)據(jù)分析等流程。該文章提出的實驗方法，可在2~3周內(nèi)完成引導(dǎo)編輯的原生質(zhì)體實驗，最快在3個月內(nèi)獲得經(jīng)過引導(dǎo)編輯的再生水稻植株。此外，該方法可以便捷地推廣到其他物種中，并隨著新型引導(dǎo)編輯工具的不斷優(yōu)化而得到更廣泛的應(yīng)用。

　　三位審稿人均對該文章給予高度評價：“作者全面、系統(tǒng)地介紹了如何在作物中實現(xiàn)高效的基因組編輯，以流暢、易讀的方式總結(jié)了引導(dǎo)編輯的實驗方法”“該論文邏輯清晰，對試圖在水稻或其他植物物種中進行引導(dǎo)編輯的研究人員非常有用”“這是一篇想對水稻、小麥或玉米進行引導(dǎo)編輯的科研人員的非常好的實驗指南”。

　　11月25日，相關(guān)研究成果在線發(fā)表在Nature Protocols（DOI：10.1038/s41596-022-00773-9）上。研究工作得到農(nóng)業(yè)農(nóng)村部、中科院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項（A類）、中國科學(xué)技術(shù)協(xié)會青年人才托舉工程、博士后創(chuàng)新人才支持計劃等的支持。

高效植物引導(dǎo)編輯實驗流程。（a）高效、自動化的pegRNA 設(shè)計方法；（b）引導(dǎo)編輯實驗設(shè)計與植物突變體獲得。

來源： 遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所