7月4日，中國科學院深圳先進技術研究院合成生物學研究所司龍龍課題組，在《自然-生物技術》（Nature Biotechnology）上，發(fā)表了題為Generation?of a live attenuated?influenza A vaccine by proteolysis targeting的研究成果。該團隊以流感病毒為模式病毒，建立了蛋白降解靶向病毒作為減毒疫苗的技術（Proteolysis–Targeting Chimeric virus?vaccine，PROTAC疫苗），為疫苗開發(fā)提供了新思路。

病毒感染與傳播危害人類健康和社會經濟的發(fā)展。流感是由流感病毒引起的一種呼吸道傳染病。流感病毒抗原性易變、傳播迅速，每年可引起季節(jié)性流行。疫苗是預防和控制傳染病最為經濟有效的手段之一。2021年，《科學》（Science）將“下一代疫苗的開發(fā)”列為125個前沿科學問題之一（www.science.org/content/resource/125-questions-exploration-and-discovery）。減毒疫苗因在免疫效果方面具備潛在優(yōu)勢而成為重要發(fā)展方向之一，如流感減毒疫苗可采用更為簡單、經濟、無痛，且與自然感染途徑一致的鼻內噴霧方式接種；可保留病毒全部或大部分抗原的天然結構，可誘導更廣的免疫應答，包括體液免疫、呼吸道黏膜免疫、細胞免疫等；可提供交叉免疫保護作用。

蛋白質作為病毒結構組成和正常生命活動所必需的共性生命物質，為研究操控病毒進而利用病毒提供了重要切入點?；诘鞍踪|調控的病毒減毒策略，大致可歸納為兩個主要方面：一是抑制或阻斷蛋白質合成以減少子代病毒組裝所需的“原料”，二是加速蛋白質降解以及時清除子代病毒組裝所需的“原料”。本研究中，司龍龍團隊構建PROTAC病毒，旨在通過操控病毒蛋白質的降解降低病毒的復制能力，將野生型病毒減毒成為疫苗。

宿主細胞內天然存在的蛋白質降解機器“泛素-蛋白酶體系統(tǒng)”為PROTAC病毒疫苗的設計奠定了關鍵生物學基礎。近年來，基于泛素-蛋白酶體系統(tǒng)的PROTAC蛋白質靶向降解技術，已用于開發(fā)基于化學小分子的蛋白降解劑【Nature Biotechnology?40, 12-16 (2022)；Nature Reviews Drug Discovery?21, 181-200 (2022)】，科研人員設計出一種具有兩個活性端的小分子化合物，一個活性端可與需要降解的靶蛋白相結合，而另一個活性端可與特定的E3泛素連接酶相結合，從而誘導靶蛋白的泛素化，進而被蛋白酶體降解。

本研究中，司龍龍團隊將宿主細胞蛋白質降解機器可選擇性降解靶蛋白的生物學機制，拓展至生命體-病毒疫苗的設計構建（圖1）。該團隊選擇流感病毒作為模式病毒，利用宿主細胞中天然存在的蛋白質降解機器，設計可條件性操控病毒蛋白質穩(wěn)定與降解的元件、工程病毒基因組，使相應的病毒蛋白在正常細胞中被泛素-蛋白酶體系統(tǒng)識別而降解，導致病毒復制能力減弱，而成為潛在的疫苗；而在疫苗制備細胞中，病毒蛋白降解誘導元件會被選擇性移除，使病毒蛋白得以保留，因此PROTAC病毒在疫苗制備細胞中可以高效復制而大量制備。

據(jù)上述設計原理，該團隊首先構建了一株PROTAC流感病毒疫苗，命名為M1-PTD。研究對病毒生長曲線考察發(fā)現(xiàn)，M1-PTD只能在PROTAC病毒制備細胞中高效復制而得以制備，而在正常細胞中復制能力顯著下降而安全（圖2）。此外，免疫熒光實驗結果表明，M1-PTD病毒蛋白在正常細胞中被降解；噬斑實驗結果表明，M1-PTD僅在PROTAC病毒制備細胞中可形成噬斑，而在正常細胞中不形成噬斑；細胞病變實驗結果表明，M1-PTD在正常細胞中不引起明顯病變。這些實驗結果均表明M1-PTD流感病毒具備成為安全疫苗的潛力。

該團隊對構建的PROTAC流感病毒的工作機理進行了驗證。結果顯示（圖3），M1-PTD流感病毒的蛋白在正常細胞中被降解而復制減弱，而宿主細胞蛋白酶體的抑制可以恢復M1-PTD的病毒蛋白水平和復制能力，說明PROTAC流感病毒的蛋白降解和復制減弱是泛素-蛋白酶體途徑依賴的，符合設計原理。

該團隊使用小鼠、雪貂動物模型對構建的M1-PTD流感病毒進行了安全性評價。研究將M1-PTD病毒或野生型流感病毒以滴鼻的方式接種于動物，監(jiān)測動物的死亡率和體重，并檢測動物鼻洗液、氣管、肺中的病毒滴度。結果顯示（圖4），與野生型病毒相比，M1-PTD在動物體內的復制能力顯著降低，且不會引起小鼠死亡或體重下降，說明其在動物體內具備安全性。

該團隊在小鼠、雪貂動物模型中對M1-PTD流感疫苗進行了免疫效果評價。結果顯示（圖5），M1-PTD可以誘導廣泛的免疫應答，包括體液免疫、黏膜免疫、細胞免疫應答；且M1-PTD可以提供良好的交叉免疫保護。

該研究基于合成生物學理念，將細胞的蛋白質降解機器生物學機制拓展至生命體-病毒疫苗的設計，為病毒疫苗開發(fā)提供了新思路，豐富了人類抵御病毒的疫苗技術武器庫，并有助于促進細胞蛋白質降解機器基礎生物學研究與疫苗研發(fā)醫(yī)學轉化的深度交叉融合。同時，該團隊提出，雖然該研究在細胞和動物模型中證明了PROTAC病毒疫苗概念的可行性，但PROTAC病毒作為疫苗的潛在應用仍需要大量的優(yōu)化和探索。

研究工作得到國家自然科學基金、中科院、深圳合成生物學創(chuàng)新研究院的支持。

論文鏈接

圖1.PROTAC病毒疫苗原理。VP，病毒蛋白(viral protein)；Ub，泛素（ubiquitin）；PTD，蛋白降解靶向元件（proteolysis-targeting domain）

圖2.PROTAC流感病毒（M1-PTD）在細胞水平的安全性

圖3.泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導M1-PTD蛋白降解和復制能力減弱

圖4.PROTAC流感病毒（M1-PTD）在BALB/c小鼠、雪貂模型中的安全性

圖5.PROTAC流感病毒（M1-PTD）在小鼠模型中的免疫原性和攻毒保護效果

來源： 深圳先進技術研究院