RNA激活CRISPR/Cas14的反式ssDNA切割活性及其應用。a.RNA觸發(fā)Cas14a1反式切割活性示意圖。b.ssDNA或RNA靶點的長度(20 nt和50 nt)和突變替對觸發(fā)Cas14a1的反式切割活性的影響。c. ATCas-RNA平臺的工作原理。從感染的樣本中提取細菌16S rRNA，然后串聯(lián)DNA聚合酶和T7 RNA聚合酶進行擴增，生成短RNA靶標激活Cas14a1/的反式裂解活性。?海南大學供圖

近日，海南大學研究員萬逸團隊和中國科學院院士李景虹團隊共同在《德國應用化學》上發(fā)表論文《靶RNA激活CRISPR/Cas14a1進行反式切割單鏈DNA而靶RNA自身不被降解》。該研究使CRISPR/Cas14a1系統(tǒng)具有診斷RNA單堿基錯配的潛力，為開發(fā)RNA單堿基診斷和成像技術奠定理論基礎。

RNA是生物體重要的遺傳物質，其堿基突變與各種疾病的發(fā)生密切相關，因此對早期生物體內RNA堿基突變進行診斷至關重要。目前，RNA堿基突變主要采用有熒光定量PCR、高通量測序、CRISPR/Cas酶法等檢測方法，由于CRISPR/Cas系統(tǒng)具有順式和反式切割的能力，可實現多種病原體的高靈敏度、定量、快速檢測，因此被廣泛應用于RNA診斷。

當前用于RNA堿基突變診斷多為CRISPR/Cas13a系統(tǒng)，其他CRISPR/Cas系統(tǒng)多需依賴結合其他方法進行。因此，急需探索其他可直接用于區(qū)分RNA堿基突變的CRISPR/Cas系統(tǒng)。

據悉,該研究以激活底物靶ssDNA做對照，設計靶RNA激活CRISRP—Cas14a1反式切割的生化實驗，包括靶RNA的長度及缺失，sgRNA靶向片段的長度及靶RNA單堿基突變等一系列試驗。課題組發(fā)現，靶RNA（20nt）激活Cas14a1反式切割活性最好，3’端相比5’端缺失堿基對Cas14a1酶的反式切割活性影響更大；Cas14a1區(qū)分靶RNA單堿基錯配能力要優(yōu)于靶ssDNA。

課題組利用靶RNA激活Cas14a1引發(fā)反式切割功能開發(fā)出ATCas-RNA分析平臺，其對檢測16s RNA基因序列相近的病原微生物具有良好鑒定能力。研究發(fā)現對25份實際樣本檢測的準確率達到100%。該技術的出現將有助于開發(fā)新的RNA分析方法，有望成為一種強大的RNA臨床診斷工具。

相關論文信息：https://doi.org/10.1002/ange.202110384

來源：《德國應用化學》