生物物理所等創(chuàng)建出RNA結合蛋白靶標研究新方法
6月10日凌晨，中國科學院生物物理研究所研究員薛愿超課題組及其合作者在Nature Cell Biology上，在線發(fā)表了題為Global profiling of RNA-binding protein target sites by LACE-seq的論文。
人類基因組編碼了約1500個RNA結合蛋白（RNA-binding protein, RBP），它們往往通過結合RNA分子上的特定基序或結構元件而調控細胞內各種RNA分子的加工、定位、翻譯和穩(wěn)定性等。研究表明，RBP在早期生殖、個體發(fā)育、細胞分化、增殖和凋亡等幾乎所有的生理過程中都發(fā)揮了關鍵的調控作用。RNA結合蛋白的突變會導致多種遺傳性疾病，比如，F(xiàn)US和TDP43的突變可導致肌肉萎縮性側索硬化癥，而U2AF35、SF3B1等的突變會導致骨髓增生異常綜合癥的發(fā)生。準確鑒定RBP的結合靶標及精確結合位置是理解其生理和病理調控機制的前提。
目前，常用的鑒定RBP靶標的方法主要有RIP-seq和CLIP-seq。由于這兩種方法均依賴于利用特異性抗體富集RBP及其所結合的RNA，且需要百萬數(shù)量級的細胞，因此，限制了這些方法在稀有細胞類型及臨床穿刺樣本中的應用。例如，RBP在早期生殖和胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮關鍵調控作用，但由于缺乏可在微量細胞甚至單細胞水平研究RBP靶標的實驗方法，導致早期生殖過程中RBP及其復合物的分子機制研究仍缺少。針對該領域存在的難題以及現(xiàn)有實驗方法的缺點，薛愿超課題組及合作者于近期開發(fā)了可在微量細胞中鑒定RBP作用靶點的新技術LACE-seq（Linear amplification of cDNA ends and sequencing）。通過線性擴增逆轉錄酶在RBP結合位點處的終止信號，該研究首次實現(xiàn)了在單堿基分辨率和單細胞層面精準鑒定RBP的結合位點，為研究RBP在胚胎發(fā)育和生殖疾病中的功能機制打開了大門。
利用創(chuàng)建的LACE-seq方法，研究團隊取得如下研究成果：（1）首次在卵細胞中繪制出Ddx4、Ptbp1、Ago2和Mili等RBP的具體靶標和結合位置；（2）率先發(fā)現(xiàn)Ago2/endo-siRNA沉默復合物在卵細胞中以非完全互補配對的方式抑制mRNA的翻譯，并證明endo-siRNA的靶標Bub3、Chk1、Nuf2等的蛋白質水平變化可能與Ago2敲除后的表型相關；（3）證明了Ago2/endo-siRNA復合物可切割由逆轉座子（Long-terminal repeat retrotransposons）啟動子起始的嵌合體RNA，該機制確保了卵細胞中轉錄組的完整性。
研究工作獲得科學技術部重點研發(fā)計劃、國家自然科學基金委和中科院戰(zhàn)略性先導科技專項等的資助。生物物理所博士研究生蘇瑞寶、副研究員曹唱唱和中科院動物研究所博士研究生樊立華為論文的共同第一作者；薛愿超、動物所及廣東省第二人民醫(yī)院教授孫青原、北京大學及北大-清華生命科學聯(lián)合中心教授黃超蘭為論文的共同通訊作者。
LACE-seq方法可在微量細胞中準確鑒定PTBP1的結合靶標
來源： 生物物理研究所
