2021年5月10日，清華大學醫(yī)學院生物醫(yī)學工程系劉鵬研究員課題組聯(lián)合北大人民醫(yī)院王俊院士團隊、北京航空航天大學陳曉芳課題組在學術(shù)期刊《Nature Communications》上在線發(fā)表類器官與芯片結(jié)合的研究新成果“Patient-derived organoids analyzed on a superhydrophobic microwell array for predicting drug response of lung cancer patients within a week”。文章將微流控芯片與腫瘤類器官這兩項前沿技術(shù)結(jié)合，顯著提高了對腫瘤患者抗癌藥物臨床療效預測的效率和時效。精準治療時代，腫瘤體外藥敏預測是個體化治療的重要研究方向。近年來腫瘤類器官技術(shù)取得重要進展，在多個癌種中均開發(fā)出預測患者對于藥物抗癌療效的體外模型。但在肺癌領(lǐng)域，腫瘤類器官模型的構(gòu)建和應用受限于效率和時耗等問題，較其他癌種更為困難。研究團隊結(jié)合了微流控芯片與腫瘤類器官技術(shù)，開展了跨領(lǐng)域、面向臨床的聯(lián)合攻關(guān)，開發(fā)出全新的集成超疏水微孔陣列芯片（InSMAR-chip），可在一周內(nèi)獲得腫瘤類器官藥敏預測結(jié)果，極具臨床轉(zhuǎn)化前景。研究團隊首先改進了腫瘤樣本的處理方法，采用機械處理方法從手術(shù)切除和活檢的新鮮腫瘤組織中培養(yǎng)出大量肺癌類器官（lung cancer organoids, LCOs），證實LCOs保留了親代腫瘤的組織學與遺傳學特征，并具有無限傳代擴增的潛力。同時，團隊開發(fā)了InSMAR-chip，將其用于LCOs的高通量三維培養(yǎng)和分析。由于芯片上的微孔體積為納升量級，大幅降低樣本消耗量和培養(yǎng)時耗，僅在一周時間內(nèi)完成藥物反應的測試，并獲得藥敏結(jié)果。后續(xù)實驗充分證明了這些藥物測試結(jié)果與患者來源的異種移植物、腫瘤的基因突變和臨床結(jié)果高度吻合。LCOs模型與微流控芯片的結(jié)合，為臨床上預測患者特異性藥物反應提供了一種有效、可靠的技術(shù)手段。研究結(jié)果
1. 患者癌組織來源的LCOs的培養(yǎng)
團隊采用機械方法共處理了103例手術(shù)切除的肺部腫瘤樣本，其中71例腺癌(AC)、23例鱗狀細胞癌(SCC)、4例小細胞肺癌(SCLC)和5例其他類型的肺癌，最終的類器官培養(yǎng)成功率為79%（55/71 AC，18/23 SCC，4/4 SCLC，4/5其他類型肺癌）。
圖1. 從患者腫瘤中建立LCOs，用于隨后長期培養(yǎng)以及為期一周的InSMAR-chip上藥物敏感性試驗流程圖2. LCOs的特征團隊所建立培養(yǎng)的LCOs保留了原始腫瘤組織的組織學和遺傳學特征，并且能在長期體外培養(yǎng)和傳代后保持穩(wěn)定，下圖結(jié)果表明第0代的LCOs具有腫瘤類器官的主要特征。圖2.肺癌組織和衍生的腫瘤類器官的H&E和免疫組化染色圖像。H&E染色結(jié)果顯示LCOs具有3D結(jié)構(gòu)，與體內(nèi)腫瘤一致。來源于腺癌的LCOs維持腺泡或?qū)嶓w結(jié)構(gòu)，甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子1（TTF- 1）和細胞角蛋白7（CK7）的表達模式也保留在類器官結(jié)構(gòu)中。鱗狀細胞癌類器官細胞LC97-O表現(xiàn)出低分化、高增殖、p40陽性表達和CK5/6部分表達，再現(xiàn)了原始腫瘤組織的特征。圖3.肺癌組織、LCOs對全基因組拷貝數(shù)變異（CNV）的熱圖。在原始肺癌組織中發(fā)現(xiàn)的DNA拷貝數(shù)增加（紅色）和減少（藍色）保存在相應的腫瘤類器官中。與原始腫瘤組織（T：組織，O：類器官）相比，所有LCOs均可見信號放大。3. 集成超疏水微孔陣列芯片藥物敏感性測試驗證集成超疏水微孔陣列芯片具有通量高、體積小、節(jié)約樣本和試劑并可進行實時的追蹤和尋址的特征，該芯片表面由于注入了超疏水涂層，使得微孔之間具有物理隔絕，保證了每個微孔獨立的液體環(huán)境，便于加樣和換液的操作，此外，芯片微孔間距與1536孔板保持一致，更適配商用的成像及檢測儀器。圖4.在微孔中具有液滴陣列的InSMAR-chip芯片圖。由于接觸角大于160°的超疏水表面的排斥作用，當多余的培養(yǎng)基從芯片中吸出時，可在微孔陣列中自發(fā)形成均勻的培養(yǎng)基液滴陣列。圖5. LCOs芯片上和芯片外培養(yǎng)對比。在第7天時，四個LCOs的生長速率（g）和生存力（h）的比較表明，在芯片上和芯片外培養(yǎng)的LCOs之間沒有顯著差異（n = 20，結(jié)果顯示為均值+ SD）。圖6.在InSMAR-chip上進行為期一周的藥物敏感性試驗的流程圖。AB-1：藥物處理前用alamaBlueTM進行細胞活力測試，AB-2：藥物處理后細胞活力測試。圖7.使用PDX衍生的類器官（PDXO）與基于PDX小鼠模型的藥物敏感性測試的比較過程圖4. 基于LCOs的為期一周的藥物敏感性測試對肺癌靶向藥物的療效預測在芯片上進行的LCOs對肺癌靶向藥物的療效預測，可早于NGS檢測獲得療效預測結(jié)果，并與基因突變結(jié)果一致。圖8. EGFR突變型LC132O和EGFR野生型LC133-O擬合的劑量-反應曲線提示兩例腫瘤對靶向藥物敏感性的差異，與臨床結(jié)果非常一致。5. 為期一周的藥物敏感性試驗代表了腫瘤對化療的反應異質(zhì)性圖9. 肺腺癌類器官對順鉑化療的異質(zhì)性反應。擬合的劑量-反應曲線顯示了AC類器官對培美曲塞+順鉑（PC）和吉西他濱+順鉑（GC）的反應。每個數(shù)據(jù)點代表3次重復的平均值。右邊的熱圖是兩個對PC敏感的類器官和另外兩個對GC敏感的類器官的例子。R表示未擬合得到IC50。圖10. 左側(cè)的藥物反應曲線顯示了使用LC96-O對三種化療方案（PC，GC和紫杉醇+順鉑）進行芯片上藥物反應檢測結(jié)果。右邊的折線圖表示用于LCOs相同的化療方案的PDX的腫瘤體積。這3種基于順鉑的化療方案中，沒有一種能有效降低類器官的存活率。對PDX小鼠給予相同的化療藥物，均未能有效抑制異種移植瘤的生長，這與基于LCOs的檢測結(jié)果一致。盡管未成功確定有效藥物，這些數(shù)據(jù)表明，基于LCOs的芯片藥物篩選應用于為個體患者精確選擇抗癌藥物的可行性。綜上所述，研究團隊建立了一套有效的肺癌樣本處理和分析方法，成功將藥敏試驗縮短至一周，相比基于PDO的藥敏試驗長達數(shù)周甚至數(shù)月的檢測時長，新方法的時效性優(yōu)勢突出，檢測時長符合臨床實踐的要求。使用InSMAR-chip進行LCOs藥物敏感性檢測的結(jié)果，通過與PDX模型、基因突變和臨床實際療效的對比，均證實能夠預測體內(nèi)腫瘤對抗癌藥物的反應，并具備藥物篩選的潛力。相信這項芯片與類器官結(jié)合的前沿技術(shù)會為腫瘤類器官預測藥物臨床反應帶來新的突破，研究團隊將繼續(xù)協(xié)同努力，期待將這項技術(shù)在未來發(fā)展出更多的應用場景，并轉(zhuǎn)化于臨床，打通精準醫(yī)療的最后一公里。清華大學醫(yī)學院博士胡亞偉、北京大學人民醫(yī)院胸外科副主任醫(yī)師隋錫朝為本文共同第一作者，劉鵬研究員、王俊院士和陳曉芳副教授為該論文通訊作者。原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-22676-1.
內(nèi)容來源：清華大學醫(yī)學院
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